蛋白质组学（TMT+label-free）破译衰老密码
众所周知，干细胞的老化被认为是导致组织和器官老化的根本原因，尤其是在高周转率的生物系统中，比如造血作用。随着干细胞的老化，受损组织被替换的潜能也会随之减弱，在人体中，贫血，适应性免疫系统能力的下降，以淋巴细胞为代价的骨髓细胞的扩张，以及频发的血液系统恶性肿瘤，这些都已经被报道与衰老息息相关。但是这些变化的机制仍然难以捉摸。2018年新发表于NATURE COMMUNICATIONS上的来自欧洲分子生物学实验室的科学家们就关注该方向，这项研究的首要目的就是利用TMT和labelfree技术对人类hpc细胞以及骨髓壁龛中的细胞群老化过程进行研究，从而揭秘衰老的分子机制。
研究材料
59例年龄在20到60岁之间的志愿者，对通过髂后嵴穿刺得到的细胞进行分离，得到HPC细胞，和其它5种与骨髓壁龛相关的细胞：LYM（淋巴细胞和前体），MON（单核细胞/巨噬细胞和前体），GRA（粒细胞前体），ERP（红细胞前体），MSC（间充质干细胞/wd基质细胞）。
技术方法
TMT标记定量蛋白质组和label free分级非标记定量蛋白质组学（如下图）。转录组学研究提供了潜在分子机制的蓝图，并指出与年轻的HPCs相比，老化HPC中与细胞周期，骨髓谱系规范以及髓样恶性肿瘤相关的基因上调。基于TMT的定量方法，准确测定同一细胞群内衰老过程中的变化，而利用 label free(LF)的方法来评估不同细胞群之间的蛋白质丰度。这也是本文的一个创新点，利用2种定量组学来分别分析细胞群内和细胞群之间的蛋白水平的变化。文章还结合Single-cellRNA-sequencing法对HPCs进行了单细胞测序，检测了蛋白组中显著变化的蛋白的相关转录水平的变化。
结果分析
1. 鉴定到蛋白的结果展示
对分离得到的6种细胞分别进行label free和TMT定量分析，总共鉴定到12158中蛋白，并展示了6种细胞的鉴定数量及其之间的重叠性。
2. 对label free得到的数据进行聚类分析，结合斯皮尔曼相关系数，得到结果如下图b，可以看出常见表达的蛋白质的表达能够用区分6个不同的细胞群，这可能反映了不同的细胞系对谱系定向的特定代谢需求以及对细胞特定过程和功能的适应。为了了解不同细胞群中通路的丰度是否不同，作者对LF数据基于Reactome数据库进行了通路分析，下图C是通路结果的展示，通过数据整合分析发现一些主要的蛋白都涉及了糖酵解通路。
3. 年龄对蛋白组的影响
为了研究年龄增加与蛋白组变化之间的关系，作者对TMT数据进行Spearman's相关性分析，并基于Reactome数据库进行通路分析，这一分析揭示了蛋白质丰度中细胞类型特异性和年龄相关性的显著变化，如上图a显示了基于每个细胞群体中五个最高上调和下调的途径所筛选到的109个通路。作者还找到了一些已报道的老化标志物的变化，比如说，在老化的HPC细胞中，IRF8和DNMT1这两个都会减少。
4. 在HPC细胞中年龄影响碳代谢
通过分析，作者发现年龄引起的HPC细胞最值得关注的变化就是酶的变化，这些酶在在糖酵解，糖原分解代谢，以及脂肪酸β氧化中扮演很重要的角色。中心碳循环在衰老中发生了显著变化，图a描述了HCP细胞的葡萄糖代谢和TCA循环，箭头代表但单向反应，笔画代表双向反应，不同的颜色代表不同的表达情况，黑色代表该酶不随年龄变化，红色和蓝色分别代表显著上调和下调的酶。最终发现有17种蛋白在糖酵解和TCA循环通路中发生了显著的变化（可以考虑深入研究一下代谢组学数据）。
5. 衰老时髓样与淋巴分化的比较
另外，作者还发现，随着年龄的增长，骨髓细胞与淋巴细胞的分化程度更高。在HPC群中明确发现的17种蛋白，它们参与维持多能性，或者沿着髓系或淋巴系分化。为了描述HPCs与年龄相关的功能衰减，作者随后检测了这些蛋白的丰度随年龄的变化动态，发现与淋巴样发育和功能直接相关的2个蛋白（DNTT and BCL11A）随着HPCs老化显著减少，相反的，下游信号效应物GUCY1A3and GUCY1B3，随着HPCs老化显著增加，一氧化氮——环鸟苷酸通路信号传导已被证明可以调节造血作用，也可能表明分化倾向于髓系。
为了检查糖酵解途径的准备阶段中酶丰度的增加是否可能是CD34 +细胞谱系偏向骨髓分化的直接后果，作者分析了自年轻人（n = 2）和老人（n = 2）受试者的519个单细胞分选的HPCs的转录组结果。基于淋巴或髓样分化的信使RNA（mRNA）标记的丰度水平，对每个单独的HPC细胞进行分类（图c）。结果发现，骨髓引发的HPCs中年龄增加的糖酵解酶的mRNA水平高于淋巴引发的，而未受年龄影响的酶的转录物在两个子集中保持相似的水平。
6. 与HPCs有关的骨髓壁龛的变化
由细胞微环境产生的几个负责HPCs的归巢和外出必要因子和粘附分子，在MSCs老化时丰度都有所下降，而基质细胞衍生因子- 1（SDF-1/CXCL12），血管细胞粘附分子1（VCAM1）以及纤连蛋白（FN1）在MSCs老化时丰度都发生了增强。这些变化表明，衰老与ECM的重组以及骨髓壁龛架构的结构变化有关。
小结
这篇文章主要是通过经典的TMT和label-free的高通量组学，结合单细胞测序研究衰老过程中HPC细胞群分化与功能衰退以及对骨髓分化的偏向，且深入分析了不同的年龄表型与功能表现差异，从而揭示出衰老引起骨髓壁龛的变化，同时会引起HPC归巢涉及通路的功能的衰退，为探索衰老机制提供了强有力的理论依据，也会后期的研究提供了研究思路和方向。
