抑郁模型大鼠不同部位 miR－16表达及其与 5－羟色胺转...2
5． Western blot 法测定 SEＲT 蛋白: 使用真核膜蛋白提取试剂盒 Mem － PEＲ Eukaryotic Membrane Protein Extraction Ｒea-gent Kit( Thermo Fisher Scientific 公司，美国) 提取前额叶皮质、海马、中缝核组织的膜蛋白，并且通过 Bradford 法对蛋白进行定量。Western blot 法测定 SEＲT 蛋白的步骤按照 Huff等的文章进行。抗 SEＲT 一抗 ( 1∶ 250 稀释) ，抗 β － actin一抗( 1∶ 250 稀释) 以及辣根过氧化物酶标记的二抗( 1∶ 5000稀释) 购自加拿大 Santa Cruz 公司。使用 Chemi Doc TM XＲS +( Bio － rad 美国) 系统自带的软件分析 SEＲT 蛋白条带，并用β － actin 进行校正。
6． 实时 荧 光 定 量 PCＲ 法 测 定 miＲ － 16: 通 过 miＲcutemiＲNA
提取分离试剂盒 ( 北京天根生化科技有限公司) 提取脑脊液、前额叶皮质、海马、中缝核总 ＲNA，用 nanodrop( 美国thermo scientific 公司) 测定其浓度及纯度; 取 2μg ＲNA 进行反转录，获得的 c DNA 用于下一步的实时定量荧光 PCＲ 扩增。U6 为 内 参 校 准 基 因，引 物 序 列: 5' － ACGCAAATTCGT-GAAGCGTTCCAT － 3'，miＲ － 16 引 物 序 列: 5' － TAGCAG-CACGTAAATTGGCG － 3'。下游引物为通用引物［北京天根生化科技有限公司 miＲcute miＲNA 荧光定量检测试剂盒( SYBＲGreen) 自带］。实时定量荧光 PCＲ 扩增程序为: 预变性 94℃2min; PCＲ 反应: 94℃ 20s，60℃ 34s
，循环 40 次，实时 PCＲ 仪购自 ABI 公司 stepone plus，使用仪器配套软件自动对数据进行分析得到每个样本的循环阈值( cycle threshold，Ct 值) ，并通过标准曲线法获得每个样本的 miＲ － 16 含量，所得数据用对应的 U6 进行校正。
7． 统计学方法: 采用 SPSS 19． 0 统计软件分析数据，组间比较采用独立样本 t 检验，相关分析采用 Pearson 相关分析。数据采用均数 ± 标准差( x ± s) 表示。以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
讨 论
本实验通过建立慢性不可预知温和应激大鼠抑郁模型，研究大鼠神经系统不同部位 miＲ － 16 表达及其与 SEＲT 的关联性，从而进一步明确 miＲ － 16 在何部位参与抑郁症的病理生理过程。在脊椎动物体内，脑组织中的 miＲNAs 远比其他组织丰富，提示miＲNAs 可能在脑功能的发挥中起着重要作用。有研究者发现，脑脊液中的 miＲNAs 可能与精神疾病相关。比如 2014 年，Muller 等的研究表明，阿尔茨海默病患者脑脊液中的 miＲ － 146a 比健康人低。但是迄今为止，尚未有抑郁症脑脊液 miＲ － 16 水平的报道。因此本实验采集了抑郁模型大鼠的脑脊液，进行 miＲ － 16 测定，结果发现其水平比对照组大鼠低。该结果有待进一步证实，以确定脑脊液 miＲ － 16作为抑郁症生物学标志物的可行性。
本研究还对脑组织前额叶皮质、海马、中缝核中的 miＲ － 16 进行了测定。有研究者发现，抑郁症自杀患者前额叶皮质中的某些 miＲNAs 存在异常，如miＲ － 494 和 miＲ － 335 比健康对照低。但是，目前尚未发现抑郁症前额叶皮质 miＲ － 16 的报道，本次抑郁模型大鼠的前额叶皮质 miＲ － 16 水平测定结果表明，模型组大鼠前额叶皮质 miＲ － 16 水平与对照组比较，差异无统计学意义，而且该部位 SEＲT 蛋白的表达亦与对照组差异无统计学意义，表明，前额叶皮质 miＲ － 16 可能不参与抑郁症的病理过程。
近年来，海马 miＲ － 16 与抑郁症的研究得到了一些研究者的关注。如张逸等在母爱剥夺大鼠抑郁模型中，发现海马 miＲ － 16 比正常大鼠高，作者认为，海马高 miＲ － 16 参与了母爱剥夺诱发的大鼠抑郁样行为的病理过程。在另外的一项研究中，抗抑郁药氟西汀能降低小鼠海马组织 miＲ － 16，如果使用人工合成的抗 miＲ － 16 对 miＲ － 16 进行中和，则抗miＲ － 16 表现出抗抑郁样作用。但是在 Bai 等的研究中，作者采用慢性不可预知温和应激建立抑郁模型，未发现模型大鼠的海马 miＲ － 16 发生改变。基于海马 miＲ － 16 在不同抑郁模型结果中的不一致性，以及 Bai 等未比较海马 SEＲT 蛋白的差异，因此本实验在测定模型大鼠海马 miＲ － 16 的同时，也分析了海马 SEＲT 的差异，结果表明，模型大鼠海马miＲ － 16 并未升高，该结论与 Bai 等发表的论文一致，而且该部位 SEＲT 蛋白的表达，与对照组比较，亦无统计学差异。以上结果表明，海马 miＲ － 16 未参与和慢性不可预知温和应激抑郁相关的病理过程，提示不同的应激所诱发的大鼠抑郁行为，其机制可能不同。
中缝核因聚集 5 － HT 能神经元，其主要功能是产生递质 5 － HT，因而在 miＲ － 16 与抑郁症的关联性研究 中 具 有 重 要 意 义。 Baudry 等 将 氟 西 汀( 1μmol/L、2μl/min) 直接缓慢注入中缝核 3 天，发现该区miＲ － 16 升高了 2． 5 倍，SEＲT 的表达降低了 2倍; 直接在该区注射 miＲ － 16( 1μl、2μmol/L) 也观察到 SEＲT 表达的下降; 然而，当氟西汀和抗
miＲ － 16一起注射的时候，SEＲT 表达未受影响，由此可见，氟西汀是通过
miＲ － 16 调节 SEＲT 蛋白的表达。然而，在抑郁动物模型中，中缝核 miＲ － 16 与对照的差异却未被报道。本次实验表明，慢性不可预知温和应激抑郁模型大鼠中缝核 miＲ － 16 低于对照组，其SEＲT 蛋白水平却高于对照组，且两者间存在明显的负相关关系。笔者认为，中缝核低 miＲ －16 状态，可导致 SEＲT 蛋白过高表达，从而影响 5 － HT 递质系统的功能，从而参与慢性不可预知温和应激造成的抑郁过程。
总之，本实验通过测定神经系统不同部位 miＲ －16 水平，探讨 miＲ － 16
参与抑郁症的可能部位及其机制。结果表明，慢性不可预知温和应激抑郁模型大鼠脑脊液和中缝核 miＲ － 16 存在异常，中缝核 miＲ －16 可能通过调节 SEＲT 蛋白表达而参与抑郁症的发病过程。
