通过2 -△△CT 方法,利用实时定量PCR技术分析相对基...（二）
要使△△ C T 计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物△ C T 如何变化。
图 1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本，都用 GAPDH 和 c-myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均 C T 值以及△ C T 值，通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对△ C T 值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于 0 ，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△ C T 方法进行相对定量。在图 1 中，直线斜率是 0.047 ，因而假设成立，△△ C T 方法可以用来分析数据。如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目 标序列和内参序列具有相同的扩增效率。
2-△△ CT 内标和参照因子的选择
使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的 RNA 进行均一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 PCR
反应内标基因包括 GAPDH ，β -actin, β 2 -microglobulin 以及 rRNA
。当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对内标基因
表达产生影响的方法在 2.2 部分有描述。
2-△△ CT
方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator
）。经内标基因均一化处理后，通过2-△△ CT
方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，△△ C T ＝ 0 ，而 2 0 ＝ 1 。
所以根据定义，未处理样本的倍数变化为 1 。而对于那些经过处理的样本， 相对于参考因子基因表达的倍数为2-△△
CT 。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选 0 时刻的样本作为参照因子。
有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。表 1 显示了大脑和肾脏总 RNA 中 c-myc 和 GAPDH 转录本的 CT 值。在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏 c-myc 表达量经 GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相 对量变化可能在任何特定的组织中都存在。
2-△△ CT 方法的数据分析
实时定量 PCR 所得到 C T 值可以很容易的输出到表格程序如 Microsoft Excel 中去。为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过 β -actin 均一化处理，我们对目标基因 fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。在 8h 的时间范围内，在每一时间点都取 3 个重复样本，每一样本在 cDNA 合成之後都做定量 PCR ，数据分析用到了公式 9 ，即：
Time x 表示任意时间点， Time 0 表示经 β -actin 校正後 1 倍量的目标基因表达。
0 时刻目标基因和内标基因的平均 C T （见图 2 第 8 栏）被用于公式 9 中。通过公式 9 计算出每一个样本目标基因表达通过 β
-actin 均一化处理後相对于 0 时刻的倍数（见图 2 第 9 栏）。平均 SD ， CV
由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法，在 0 时刻的平均倍数变化接近于 1 。我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为 1
可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与 1 偏差很大 , 则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。
在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。因此对每一个样本分别处理，通过2-△△ CT
计算後取结果的平均值就非常重要。如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均 C T, 然後再进行2-△△ CT
计算。怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。表 1 给出了目标基因（ c- myc ）和内参基因（
GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和
GAPDH 的平均 C T 来计算△ C T 。 重复实验中 C T
值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。但其中的一个难点是 C T 值与相应的拷贝数成指数关系（见第 4 部分） ,
因此，在最後的计算中，2-△△ CT 的误差通过△△ C T 加上标准偏差和△△ C T
减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比较造成的。
通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。表 2 给出了目标基因（ c- myc ）和内标基因（ GAPDH
）在同一管中扩增的实验数据。对于任意一个管子，目标基因（ c- myc ）和内参基因（ GAPDH ）扩增时加入的 cDNA
量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△ C T 值，这些值取平均後再进行 2-△△ CT 计算。
在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。
在表 1 和表 2 中，估计误差在从△ C T
到△△ C T 的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。我们把△ C T,cb
当作一个人为设定的常数来减去，得到△△ C T 。这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的 C T
值求2-△△ CT 所得结果 相当。另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的１倍的量，在这种情况下，平均△ C T,cb
的误差值被引入到每一样本的△△ C T 中。在表１中，肾脏中△△ C T 变成－ 2.50±0.20 而经过校正的 c-myc 量是 5.6
倍，范围从 4.9 到 5.6 。而在大脑中的结果是没有误差的１倍.
