植物基因组总DNA的分离———SDS法
实验方法原理
SDS(十二烷基磺酸钠)是一种强去污剂,可使细胞膜及核膜破裂,因此被用来分离DNA。该分离过程的第一步是用热的去污剂(SDS)进行抽提,然后将抽提物置于0℃并加入高摩尔浓度的乙酸钾,离心去除不溶物,以去除蛋白和多糖类杂质。
实验材料 植物新鲜叶片
试剂、试剂盒 液氮提取缓冲液(用前加入)20%SDS(pH7.2)乙酸钾5×TE缓冲液RNaseA乙酸钠异丙醇TE缓冲液
仪器、耗材 天平 研钵和研棒 50ml 离心管 恒温水浴锅 冰盒 冷冻离心机 ( 至少可达25 000×g) - 20℃冰箱 Eppendorf 管 微量移液器及吸头 微量离心机 冰箱
实验步骤
1.将2g新鲜植物叶片置于液氮中速冻,用研钵磨成细粉。
2.将冷冻粉末转移至一50ml离心管中并加入15ml提取缓冲液。轻轻旋转混匀。
3.加入1ml20%SDS,混匀,65℃保温10min,并不时轻轻旋转混匀。
4.加入5ml 5mol/L乙酸钾,混匀后冰上放置20～30min。
5.25000×g,4℃离心20min。
6.上清液用纱布过滤,转移至一干净的50ml离心管中,加入10ml异丙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃放置40min沉淀核酸。
7.2000×g,4℃离心20min,去上清液,晾干沉淀5min。
8.用700μl5×TE缓冲液溶解沉淀并转移至一Eppendorf管中。
9.加入7μlRNaseA贮液,37℃保温1h。
10.加入75μl3mol/L KAc,轻弹混匀,离心15min沉淀不溶性杂质。
11.将上清液转移至一装有500μl异丙醇的干净管中,轻轻混匀,室温下放置5min。
12.微型离心机离心15min沉淀DNA,去上清液并用500μl70%乙醇清洗沉淀。再次离心5min,吸去乙醇。
13.沉淀物溶解于200μlTE缓冲液中,4℃保存。
注意事项
1.将SDS溶液加入到化冻的提取物中时,可能会有沉淀析出,要保证析出的SDS重新溶解,以及65℃保温时提取物混合均匀。
2.在高浓度(>1mol/L)的钾离子存在的情况下,SDS会与蛋白质或多糖结合变成不溶性的十二烷基磺酸钾复合物,这类复合物通常呈絮状,必须要经较高转速离心和纱布过滤予以去除
其他
RNaseA 为2000U/ml,经热处理
