凝集反应实验原理和方法（直接凝集反应和间接凝集...(2)
（一）正向间接血凝试验
将绵羊红细胞或人的“ O”型红细胞用醛类固定（称为醛化，可改变血球表面性质，使其易于吸附蛋白质类抗原，并可长期保存使用），再将可溶性抗原吸附于醛化的血细胞上，制成抗原致敏的红细胞，当与相应的抗体结合，使红细胞被动的聚合在一起，出现肉眼可见的凝集现象，常用于检测传染病抗体或自身抗体。
【 实验材料 】
（ 1）抗原制备：将伤寒杆菌接种在培养基上，37oC培养24小时，用生理盐水洗下，100oC水浴2小时，离心弃上清，稀释后备用。
（ 2）致敏红细胞的制备：取稀释的抗原与等体积的已醛化的2%SRBC混合，37oC水浴2小时，每隔15分钟振摇一次，取出后洗涤弃上清，稀释成0.5% 备用。
（ 3）试管、试管架、刻度吸管、恒温水浴箱。
【 实验方法 】
（ 1）取8支小试管排列于试管架上，依次编号。每管加入0.25ml生理盐水。于第1管内加入1:10稀释的免疫血清0.25ml混匀，倍比稀释至第7管。第8管为阴性对照。
（ 2）每管中加入0.25ml致敏绵羊红细胞，振摇试管架，使之充分混匀。
（ 3）将试管架静置于37oC恒温水浴箱中1小时。
正向间接血凝试验操作程序
【 结果分析 】
（ 1）首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底红细胞沉积呈圆形，边缘整齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。
（ 2）观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级：
++++ 细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。
+++ 细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。
++ 约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。
+ 仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。
— 液体混浊，无凝集。
（ 3）血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象（++）的血清最高稀释度作为受检血清的抗体效价。
【 注意事项 】
• 红细胞需来自同一个体、批号相同，且致敏血球应新鲜配置。
• 使用器材必须清洁，否则对结果有很大影响。
（二）反向间接血凝试验
将特异性抗体吸附于醛化的红细胞上，再与相应抗原结合，在适量电解质存在条件下，红细胞被动聚集出现肉眼可见凝集现象。用于检测标本中的相应可溶性抗原。
【 实验材料 】
（ 1）1:20抗—HBs致敏的醛化血球、纯化的1:20抗—HBs、待检血清、稀释液。
（ 2）“V”型微量血凝板，0.025ml稀释棒、微量搅拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）。
【 实验方法 】
（ 1）配制致敏血球悬液 于每瓶冻干诊断血球加4ml稀释液，轻轻旋摇使成均匀血球悬液，浓度约为0.6%。
（ 2）正式试验
① 在“V”型微量血凝板上，每份待检血清设立8孔，于各孔内用40滴/ml滴管各加1滴稀释液（相当于0.025ml）。
② 用0.025ml容量的稀释棒蘸满待检查血清分别依次在各孔内捻转作倍比稀释（一般每孔内均需捻转10次左右），直至第7孔，第8孔为致敏血球对照。另设第9孔为阳性对照，加0.025mlHBsAg阳性血清。
③ 于每孔中加0.025ml混匀的致敏血球悬液。
④ 将血凝板置于微型振荡器上振荡1~2分钟，置37oC1小时后观察结果。
反向间接血凝试验操作程序
【 结果分析 】
不凝集：红细胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圆点。
明显凝集（++）：红细胞于孔底形成薄膜状凝集，中央可见疏松的红点。
出现明显凝集的血清最高稀释度为 HBsAg效价，凡效价≥1:16者需进一步做中和试验。
中和试验
在血凝板上每份标本设测定排与对照排，每排
8孔。于每孔加稀释液0.025ml，用2支稀释棒蘸取被检血清，分别在2排作倍比稀释到第7孔，第8孔不含血清，为血球对照，然后，于测定排各孔加稀释液0.025ml，对照排各孔加1:20抗HBsAg0.025ml，血凝板振荡1~2分钟，置37oC30分钟。取出，于各孔加0.025ml致敏血球，振摇混匀，置37oC1小时后观察结果。
凡正式试验效价≥ 1:16，且中和试验的对照排凝集孔数至少低于测定排凝集孔数2孔者，为HBsAg阳性，否则系非特异性凝集。
【 注意事项 】
（ 1）配制的致敏血球悬液一般当天用完，若置2~10oC，使用期不超过3天。
（ 2）试验用的血凝板、滴管、稀释棒等器材必须十分清洁，否则易造成非特异性凝集。
• 血凝板、稀释棒用后均需用次氯酸钠（ 10%v/v）浸泡过夜；滴管需煮沸10分钟，然后用水冲净，再用蒸馏水冲洗，晾干备用。
