方案5 用 RP-HPLC 技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐实验
| 实验材料 | 蛋白质或多肽样品 |
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| 试剂、试剂盒 | 乙腈（HPLC级）2 -丙醇硝酸钠硫脲三氟乙酸 |
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| 仪器、耗材 | 分析型 HPLC 装置色谱柱洗脱液瓶Hamilton 玻璃注射器氮气量筒微量离心机流动相过滤装置 |
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| 实验步骤 | 一、流动相的配制1.配制缓冲液 A(弱流动相）和缓冲液 B(强流动相）各 1L，例如： 缓冲液 A:0.1%TFA 水溶液。 缓冲液 B:0.09%TFA 的 2-丙醇溶液。 要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。
2.在备好的量筒中用 Teflon 包被的磁转子将溶液搅拌均勻（时间视体积而定）。 3.用 0.2ul PTFE 过滤器过滤缓冲液 A 和 B。 4.将洗脱液瓶用塞子封闭，以防止有机溶剂挥发。 二、多肽和蛋白质样品的制备1.检查样品的纯度。 2.如果存在不溶的蛋白、固体颗粒，则要用 0.2ul PTFE 滤膜过滤，或者离心样品后取上清液。 三、用 RP-HPLC 进行蛋白质脱盐1.检测 HPLC 系统。（1）进空白样（用洗脱液 A 进样），先在 100% 洗脱液 A 中等梯度洗脱，再在 100% 洗脱液 B 中等梯度洗脱，所有条件都与蛋白样品相同。 （2）用硫脲或硝酸钠（或其他不会发生交叉反应的溶液，例如盐溶液）来测量柱的死体积，从而确定盐的洗脱时间。 2.蛋白质脱盐。（1）将含盐样品注入反相柱中，用 100% 洗脱液 A 洗脱，盐洗脱时间接近或正好是柱的死时间。 类似的方法可用于洗脱脲、盐酸胍等或样品中的许多低分子量成分，以备用于还原烷基化反应后或溶解/重折叠研究。它们来源于化学衍生反应、主链解离或部分还原反应、亚基-亚基解离，此外还可能来源于离子交换色谱、生物特异性亲和色谱或疏水相互作用色谱。 （2）用 100% 洗脱液 B—步洗脱或多步梯度洗脱蛋白。 （3）收集含蛋白的组分，以便进一步分析。
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