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32P标记裂解培养细胞— 温和去垢剂裂解法（对非贴壁）

2019.4.05

实验材料	待标记的培养细胞
试剂、试剂盒	37℃标记培养液 1 Ci／ml H3(32)PO4(溶于 HCl)冰冷 Tris 平衡盐水(TBS) ／磷酸盐平衡盐水(PBS)温和裂解缓冲液／RIPA 裂解缓冲液
仪器、耗材	树脂玻璃挡板(1 in 厚)取液器吸头树脂玻璃盒 37℃微量离心管一次性吸管橡皮细胞刮子 Sorvall 冷冻离心机(或其他)树脂玻璃薄板／4℃ 树脂玻璃管架
实验步骤	实验前准备具体见其他： 1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。生长旺盛的细胞中磷酸盐转运达到最高峰，除非研究静止期细胞的蛋白质磷酸化，一般待标记的细胞生长密度应低于最大密度，标记前 3～18 h 换新鲜的培养液培养将有利于标记。 2. 1800 g 离心 1 min，吸去培养上清，将细胞用含血清不加标记物的标记培养液重悬，再次离心吸去培养液。 3. 每 10⁷ 细胞加入 2 ml 标记培养基，转移至适合大小的培养平皿。 4. 在树脂玻璃挡板后操作，使用配备塞有棉花防浮质吸管的微量移液器加入 ³²P 至终浓度为 0.1～2 mCi/ml。标记 1～2 h 已足够，但细胞可在 6 h 内耐受高达 2 mCi/ml 和在 18 h 内耐受低浓度（0.1～0.5 mCi/ml）的辐射。 5. 将培养皿置于预热的树脂玻璃盒中，并将盒子置于培养箱中。 6. 标记结束时，将装有标记细胞的树脂玻璃盒移至冷室，放在树脂玻璃挡板后面。 7. 从树脂玻璃盒子中取出培养皿，将细胞移至带螺口盖的微量离心管中，1800 g 离心 1 min 回收细胞，吸尽培养液。 8. 细胞用小体积的冷 TBS 重悬，移至带螺口盖微量离心管中，1800 g 离心 1 min，吸尽 TBS。 9. 每 10⁷ 细胞用 0.5～1 ml 裂解缓冲液悬浮细胞，用一次性的巴斯德吸管轻轻混匀， 4℃ 放置 20 min。 10. 盖上管盖，于 4℃ 26000 g离心30 min澄清裂解液。 11. 离心后，将上清（裂解物）移至新离心管中，离心管和沉淀作为同位素污物处理。 12. 用凝胶电泳、免疫沉淀或蛋白质纯化方法，分析标记的裂解液，所有过程均在 4℃ 适当屏蔽下进行。展开
注意事项	1. 管内液体最好是装至半满以防液体溅出。 2. 用 RIPA 缓冲液制备裂解液时，由于细胞核的溶解常导致细胞裂解液变得黏稠。当发生这种情况时，延长离心时间到 90 min，或离心前在 RIPA 液中加入 50 μl 固相化金黄色葡萄球菌，都可使 DNA 沉于管底。 3. 除非特别说明，细胞培养在加湿的 37℃，10% CO₂ 培养箱
其他	试剂：标记培养液：不含磷酸盐的细胞培养液（如DMEM），添加了常规浓度的血清或用无磷酸盐的盐水透析过的血清，37℃ 溶于 HCl 中的 1 Ci/ml H₃³²PO₄ （无载体，ICN） Tris 平衡盐水（TBS）或磷酸盐平衡盐水（PBS），冰冷温和裂解缓冲液或 RIPA 裂解缓冲液仪器： 1 in 厚的树脂玻璃挡板塞有滤芯的防浮质的取液器吸头树脂玻璃盒，预热到 37℃ 带螺口盖的微量离心管一次性的吸管（塞有棉花）橡皮细胞刮子 Sorvall 冷冻离心机，带 SM 24 转子和橡皮套管，或其他相当的冷冻离心机，4℃ 树脂玻璃薄板（10 in × 10 in × 1/4 in）或树脂玻璃管架，4℃ 展开