PVDF膜上蛋白的可逆染色
PVDF膜上蛋白的可逆染色
Western杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。
1. 氨基黑染色
染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid.
染色：将PVDF膜置于染液中染色数钟，ddH2O 脱色。
2. 考马氏亮蓝染色
染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v)
脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)
染色：将PVDF膜置于染液中染色15 min.，脱色液脱色。
3．丽春红染色Ponceau S
染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)
染色：将PVDF膜置于染液中染色5min
脱色：ddH2O 脱色
三、银染
PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质谱兼容。其中方法1敏感性最高，方法3背景最低、对比度好。
1. Blam silver staining protocol (Modified)
程序 | 溶液 | 时间 |
固定
| 40%ETOH 10%HAC | 1小时
|
漂洗 | 30%ETOH | 2×20min |
致敏 | 0.02%Na2S2O3 | 1min |
漂洗 | H2O | 3×20Secs |
染色 | 0.1%AgO3(预冷) | 4℃，20mins |
漂洗
| H2O H2O(更换盘子) | 3×20Secs 1min |
显色
| 3%Na2CO3 0.05%甲醛 | |
漂洗 | H2O | 20Secs |
中止 | 5%Hac | |
漂洗 | H2O | 3×10min |
贮存 | 1%Hac,4℃ |
2. EMBL Silver Staining Protocol
程序 | 溶液 | 时间 |
固定
| 50%MeOH 5%HAc | 20min
|
漂洗 | H2O | 2hr或过夜 |
致敏 | 0.02%Na2S2O3 | 1min |
漂洗 | H2O | 2×1min |
染色 | 0.1AgNO3 (预冷) | 20min |
漂洗 | H2O | 2×1min |
显色
| 2%Na2CO3 0.04%甲醛 | |
中止 | 5% HAc | |
贮存 | 1% HAc，4℃ |
3. Vorum Silver Staining Protocol
程序 | 溶液 | 时间 |
固定
漂洗
致敏
漂洗 染色
漂洗 显色
中止
贮存 | 50%MeOH 12%HAc 0.05%甲醛
35%EtOH
0.02%Na2S2O3
H2O 0.2AgNO3 0.076%甲醛 H2O 6% Na2CO3 0.05%甲醛 0.0004% Na2S2O3 50%MeOH 12%HAc 1%HAc，4℃ | 2hr或过夜
3×20mins
2min
3×5mins 20min
3×5mins
5mins |
注意事项：
1.应严格按照操作步骤进行；
2.显色前最好更换新染色盘；
3.显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染一块胶应配制500ml染液。更换2-3次；
4.市售甲醛的浓度为37%；
5.三种方法均与质谱兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL法次之但背景较低，染色点较黑。Vorum相对不敏感，但背景清晰，信噪比高。
