HBV变异对乙肝病毒检测的影响
［摘 要］ 目的：了解无锡地区HBV前C／C基因变异情况,探讨基因变异对乙肝病毒标志物(HBVM)及HBV DNA定量的影响。方法： HBVM用时间分辨荧光定量试剂检测;HBV DNA定量PCR以德国Roche Lightcycler 荧光定量扩增仪检测;HBV DNA前C／C测序使用①德国Roche Mag NA Pure LC 全自动核酸提取，加样系统;②美国Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。结果： 92例乙肝患者血清中有41例(44 6％)发生前C／C区nt1896位变异,41例中有34例HbeAg阴性,7例HbeAg仍为阳性;以nt1896位是否变异分组,变异组和未变异组HBV DNA定量无显著性差异。结论： nt1896位变异导致HBeAg转阴,HBV病毒变异对HBVM有决定性的影响,但该变异对HBV复制无影响。
HBV感染在临床可产生不同的肝脏疾病谱,过去多以HBV免疫学标志物来判断病毒感染状况［1］。但随着分子生物学技术的发展,研究发现肝脏疾病谱不仅与宿主的免疫有关,也与病毒本身密切相关,即HBV 本身也存在变异。对HBV变异的判断,最可靠和精确的方法是从病人体内检出HBV DNA,用DNA测序法来确定病毒的变异,目前对于HBV的变异的研究比较集中在关于前C区及S基因区的变异。本文结合92例乙肝患者的PCR定量、免疫学标志物定量结果以及DNA前C／C区测序结果报道如下。
1 材料与方法
1 1 分析对象
本组92例为无锡地区2004年1月~10月在无锡市传染病医院门诊及住院的乙肝患者,均为HBVDNA阳性病人。
1 2 检测方法
1 2 1 乙肝病毒标志HBsAg、抗 HBs、HBeAg、抗 Hbe和抗 HBc以美国PE1235automatic immunoassay system 检测,试剂为上海新波产的两对半时间分辨荧光定量试剂。
1 2 2 定量聚合酶联反应(PCR)HBV DNA定量PCR 以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测,试剂为深圳匹基产HBV DNA荧光定量试剂。
1 2 3 HBV DNA前C／C区测序 使用①德国Roche MagNA Pure LC全自动核酸提取、加样系统,获得HBV DNA模板;②在美国PE 9600扩增仪扩增:94℃预变性3 min,94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,循环35次;③用Promega公司的PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物;④纯化产物用Beckman测序试剂盒进行测序反应:96℃ 20 s,55℃ 20 s,60℃4 min,循环30次,终止测序反应,然后在美国Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System上得到HBV DNA 的序列和图谱。所测HBV DNA序列的碱基位置:nt1737 2483,所测长度:746 bp,上游引物序列及位置:5’ GAGTTGGGGGAGATTAG 3’(1737 1756),下游引物序列及位置:5’ AAAGTTTCCCACCTTATGAGTC 3’(2483 2462);引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1 2 4 统计学处理 采用t检验和χ2检验。
2 结 果( 略)
3 讨 论
表1中HBV DNA 1827位ntc→a突变达88％, 表2 HBVM与1896位变异表3 1896位变异与e抗原相关性表4 病毒与DNA定量相关性基本体现无锡地区HBV DNA单核苷酸多态性突变水平,意义目前不详。1896位ntg→a突变达44 6％(41／92),据国外报道,这种变异大多发生在亚洲东部及南欧地区,发生率可以高达47％～60％,而在美国只有10％左右,胡耀仁等［2］报道宁波乙肝患者1896位变异率为42 58％,本文结果与报道相近。由于1896位ntc→a突变(鸟嘌呤→腺嘌呤),使原来编码色氨酸的前C区第28个密码子(TGG)转变为翻译终止密码子(TAG),因而前C蛋白的翻译中断,HBeAg不能产生,检测会出现阴性结果,从表3中可见,与变异有关HBeAg转阴有34例,从而证实1896位变异与HBeAg转阴具有密切相关性。2005位ntt→a突变和2074位ntt→c突变因为是密码子的第三碱基发生突变,翻译的氨基酸仍是原来的氨基酸,属同义突变。
图谱分析是测序仪利用4种荧光染料分别标记终止物ddNTP,通过电泳将各个荧光标记片段分开,经激光扫描,光栅分光,区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,在 CCD摄影机上同步成像。图1显示1896位正常为G,图2显示1896位发生突变为A。
从表3可以看出(由表2中统计而来),1896位变异组共有41例,其中34例e抗原阴性,说明与1896位变异有密切关系(P<0 005);有7例e抗原仍为阳性,可能与体内仍存在野生株复制的情况有关。在51例1896位未变异一组,其中13例e抗原阴性,而HBV DNA定量显示有病毒的复制,与理论结果不符,原因可能与其他位点变异有关。
从表4中可以看出以nt1896位变异分组,两组病毒DNA定量无显著性差异(P>0 05),说明1896位变异会导致HBeAg不能产生,检查阴性结果,但不能反映HBV复制减轻和消失,而仍有HBV前C区变异病毒的存在和复制,结论与文献相符［3］。
李伯安等［4］认为单独的血清学标志检测不能反映肝脏的病变程度,也不能良好反映病毒的复制。
临床上对不同肝脏疾病谱的认识,有必要结合二对半结果和PCR DNA定量以及基因测序结果,才会对乙肝病毒的感染状况有一个比较准确的判断,才能对症治疗,取得较好的治疗效果。由于前C／C区1896位的变异,导致HBeAg转阴,不能就此而否定病毒的复制。
测序结果表明,HBV病毒基因变异对HBVM结果产生根本性的影响,它们是基因型和表现型的关系,即基因型决定表现型,但病毒复制继续进行。
