mRNA 的 PCR 差异显示实验
| 实验方法原理 | |
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| 实验材料 | 人的细胞总 RNA 或 poly（A）＋ RNA |
| 试剂、试剂盒 | 人胎盘 RNase 抑制剂 DNase I Tris·Cl KCl MgCl2 3：1 （V V） 苯酚 氯仿 乙酸钠 乙醇 DEPC 处理的水 简并锚定 oligo（dT） 引物组合 MoMuLV 逆转录酶缓冲液 DTT 4dNTP 混合物 MoMuLV 逆转录酶 PCR 扩增缓冲液 ［α-33P］ dATP 随机十聚体 Taq DNA 聚合酶 矿物油 甲酰胺上样缓冲液 糖原（无 DNase） |
| 仪器、耗材 | 65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴 热循环仪 Whatman 3 MM 滤纸 |
| 实验步骤 |
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 消化细胞总 RNA 或 poly（A）＋ RNA 中的 DNA： 50 ug RNA 10 ul 1 U/ul 人胎盘 RNase 抑制剂 1 /ul 10 U/ul 无 RNase 的 DNase I 5 ul 0.1 mol/L Tris·Cl，pH 8.3 5 ul 0.5 mol/L KCl 5 ul 15 mmol/L MgCl2 加水到 50 ul 37℃ 温育 30 min。 2. 加入 50 ul 酚/氯仿（3：1），涡旋混勻，最高速离心 2 min 分相。 3. 转移上层到一个干净的微量离心管中，加入 5 ul 3 mol/L 的乙酸铵和 200 ul 100％ 乙 醇。-70℃ 放置 30 min 沉淀 RNA。 4. 高速离心 10 min。去除上清，用 500 ul 70％ 的乙醇洗涤沉淀（沉淀的 RNA）。 5. 溶解 RNA 沉淀于 20 ul DEPC 处理水，用分光光度计测量 A260 准确定量 RNA 的浓度。 6. 用琼脂糖/甲醛凝胶电泳分析 3 ug 用作差异显示分析的 RNA，检査 RNA 的完整性。无 DNA 的 RNA 保存在 -80℃ 直到做差异显示分析。 7. 对于每一个 RNA 样品，标记 4 个微量离心管为 G、A、T 和 C 个管子对应一个简并锚定 oligo （dT） 引物。 8. 把 1 ug 无 DNA 的 RNA （步骤 5）稀释到 0.1 ug/ul， 置于冰上。 9. 用 4 个不同的简并锚定引物（5'-T12MN-3'；T12MG、T12MA、T12MT、T12MC，M 是 G、A 或 C） 配制无 DNA 的总 RNA 或 poly （A）＋ RNA 的逆转录反应： 4 ul 5×MoMuLV 逆转录酶缓冲液（终浓度 1×） 2 ul 0.1 mol/L DTT （终浓度 10 mmol/L） 1.6 ul 250 umol/L 4dNTP 混合物（终浓度 250 mmol/L） 0.2 ug 总 RNA 或 0.1 ug poly （A）＋ RNA 2 ul 一个 10 umol/L 简并锚定 oligo（dT） 引物（T12MN； 终浓度 1 umol/L） DEPC 处理水调整体积到 19 ul。 10. 65℃ 温育 5 min 变性 mRNA 的二级结构，继续 37℃ 温育 10 min 复性引物。 11. 每管加入 1 ul 200 U/ul 的 MoMuLV 逆转录酶，混匀，37℃ 温育 50 min。 12. 95℃ 加热 5 min，灭活逆转录酶，高速离心把溶液收集到管底。把管子放在冰上马上准备 PCR，或保存在 -20℃ 以备日后使用（可以稳定保存至少 6 个月）。 13. 为每个引物准备如下 20 ul 的反应混合液： 10 ul H2O 2 ul 10× 扩增缓冲液（终浓度 1×） 1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物（终浓度 2 umol/L） 0.2 ul ［α-33P］ dATP 2 ul 12 umol/L 的随机十聚体（终浓度 0.2 umol/L） 2 ul 10 umol/L 的简并锚定 oligo（dT） 引物（T12MN； 终浓度 1 mmol/L） 2 ul cDNA （12 步） 0.25 U 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 14. 上下吹吸混勻，覆盖 25 ml 矿物油。 15. 在热循环仪上用如下程序扩增： 40 轮： 30 s 94℃ （变性） 2 min 40℃ （复性） 30 s 72℃ （延伸） 1 轮： 5 min 72℃ （延伸） 最后一步：4 C （保持） 16. 混合 3.5 ul PCR 产物和 2 ul 甲酰胺上样缓冲液，80℃ 加热 2 min。上样到 6％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶上。60W 电泳约 3 h 直到二甲苯青走到离底部 10 cm 以内。 17. 小心移去凝胶上的一块玻璃板。把一张 Whatman 3 MM 滤纸覆盖在凝胶上，在凝胶和滤纸之间不要留有气泡。不需要在甲醇/乙酸中固定，室温干凝胶约 1 h。 18. 使用放射性墨水或钟头打孔器标记 X 射线胶片和干好的凝胶移确定它们的方向。室温曝光 24～48 h。 19. 洗片，把凝胶片和凝胶比照，标出感兴趣的 DNA 条带（在不同泳道差异显示的条带）或用一支干净的铅笔或割穿凝胶片在凝胶片下作标记。 20. 用刀片割出凝胶块和黏附其上的 Whatman 3 MM 滤纸，放人一个微量离心管。加入 100 ul H2O， 室温浸泡 10 min。 21. 盖上管子煮沸 15 min。 22. 高速离心两分钟沉淀凝胶块和滤纸残渣。转移上清到一个干净的管子里。 23. 上清中加入 10 ul 3 mol/L 的乙酸钠（终浓度 0.3 mol/L） 和 5 ul 10 mg/ml 的糖原 （作为载体）。加入 400 ul 100％ 的乙醇，-70℃ 放置 30 min。4℃ 高速离心 10 min。 24. 用 500 ul 85％ 的乙醇洗涤沉淀，晾干，重新溶解于 10 ul H2O 中。 25. 在一个 40 ul 的反应体积里再次扩增 4 ul 洗脱的 DNA。使用和步骤 13～15 中同样的简并描定引物和 PCR 条件，不同的是加入 250 umol/L 4dNTP 混合物（终浓度 20 umol/L） 代替 1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物，也不加同位素。-20℃ 保存剩余的回收 DNA 以备将来扩增（可稳定数年）。 26. 取每个 PCR 样品 30 ul 在 1.5％ 的琼脂糖凝胶上电泳，用 0.5 ug/ml 的 EB 染色。20℃ 保存剩余的 PCR 样品（可以稳定保存数年）。 27. 从琼脂糖凝胶上抽提所希望扩增的 DNA 条带。用它作探针进行 North-era 印迹分析和 cDNA 库的筛选。 28. 亚克隆，测序鉴定余下的 PCR 样品。
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| 注意事项 |
必须由受过正确使用 33P 同位素的人员在经 NRC 认证的地方进行。防止过量的照射，必须始终贯彻人员和仪器的同位素污染防范标准。
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| 其他 |
1. 材料 人的细胞总 RNA 或 poly （A）＋ RNA 2. 试剂 1 U/ul 人胎盘 RNase 抑制剂 10 U/ul DNase I （无 RNase） 0.1 mol/L Tris·Cl，pH 8.3 0.5 mol/L KCl 15 mmol/L MgCl2 3：1 （V/V） 苯酚/氯仿 3 mol/L 乙酸钠，pH 5.2 100％、70％ 和 85％ 的乙醇 DEPC 处理的水 浓度各为 10 umol/L 的简并锚定 oligo（dT） 引物组合 （如 Genhunter）： T12MG、T12MA、T12MT， T12MC （M 代表 G、A 或 C） 5 × MoMuLV 逆转录酶缓冲液 0.1 mol/L DTT 250 umol/L 和 25 umol/L 的 4dNTP 混合物 200 U/ul 的 Moloney 鼠白血病病毒（MoMuLV） 逆转录酶 10× PCR 扩增缓冲液（使用 15 mmol/L MgCl2， 0.1 mg/ml 白明凝胶；保存在 -20℃） 10 uCi/ul ［α-33P］ dATP（＞2000 Ci/mmol） 2 umol/L 随机十聚体（如 GenHunter 或 Operon Technologies） 5 U/ul Taq DNA 聚合酶 矿物油 甲酰胺上样缓冲液 10 mg/ml 的糖原（无 DNase） 3. 耗材 65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴 热循环仪 Whatman 3 MM 滤
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