黄曲霉毒素B1检测试剂盒使用说明（一）
黄曲霉毒素B1检测试剂盒使用说明书 （酶联免疫法）
1 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测谷物、饲料等样品中的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的黄曲霉毒素B1和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留量。
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.03ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃，30min～15min
2.3 检测下限：
谷物……………………………………0.15ppb
配合饲料………………………………0.3ppb
食用油、花生…………………………0.6ppb
酱类、麦类等饲料……………………0.3ppb
啤酒……………………………………0.3ppb
葡萄酒、酱油、醋……………………0.15ppb
2.4 交叉反应率：
黄曲霉毒素B1…………………………100%
2.5 样本回收率：
谷物及配合饲料……………………85%±15%
花生…………………………………82±15%
食用油………………………………85±15%
酱类、麦类等饲料………………83±15%
啤酒………………………………84±15%
葡萄酒、酱油、醋………………87±15%
3 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准液（黑盖）：各1ml
0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb
高标准液：100ppb…………………1ml
酶标记物（红盖）…………………5.5ml
抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
说明书………………………………1份
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂：甲醇、正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液1：样品提取液
70%甲醇，即V甲醇:V去离子水=7：3。
配液2：1×工作洗涤液
将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1 谷物处理方法
1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加5ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：5 检测下限：0.15ppb
5.3.2 玉米皮、麦麸等吸水性强的样本处理方法
1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加20ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；（对于毒素含量极高的样本可用35%的甲醇稀释后再测。比如取2）中的混合液0.1ml加35%的甲醇0.9ml混匀，最终样本稀释倍数为200，检测下限为6ppb。）
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：20 检测下限：0.6ppb
注：由于毒素在样本中的分布呈非均匀状态，取样时需多点取样充分混匀后再取2g进行试验。
5.3.3 配合饲料处理方法
1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加10ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：10 检测下限：0.3ppb
5.3.4 食用油、花生、高油脂的饲料处理方法
1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加8ml正己烷和10ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）去除上层液体，取0.5ml下层液体加入0.5ml去离子水，混匀，再取混匀液体0.5ml加入0.5ml 35%甲醇，振荡30S；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：20 检测下限：0.6ppb
5.3.5 酱类、麦类、饼干、糕点等食品或调料，以及饲料浓缩料等饲料处理方法
1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加10ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取2ml上清，加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
3）转移上层液体到另一容器中，下层液留置备用，向上层液中再加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），充分振荡混5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
4）去除上层液体，合并两次的下层液体并充分混匀；
5）取合并后的下层液体2ml于50-60℃氮气下吹干；
6）加入0.5ml样品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去离子水混匀；
7）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：10 检测下限：0.3ppb
5.3.6 啤酒处理方法
1）将啤酒充分搅拌（去除CO2），取2ml啤酒样品，加入1ml蒸馏水，再加入7ml甲醇，振荡5分钟；
2）取混匀后的样品液0.5ml加入0.5ml去离子水，混匀；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：10 检测下限：0.3ppb
5.3.7 葡萄酒、酱油、醋处理方法
1）取2ml样品，加入2ml蒸馏水，再加入10ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取下层液体1ml于50-60℃氮气下吹干；
3）加入0.5ml样品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去离子水，混匀；
5）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：5 检测下限：0.15ppb
