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自动DNA合成仪仪器的故障排除

2021.8.27

化学合成方法与生物化学方法之间有着显著的差别,材料和方法上非常小的改变常常会在所获得的产物以及保证可靠的合成路线之间造成差别。下面介绍几个zui可能引起故障的经验问题。
1.溶剂
大多数用在化学合成中的商品试剂都不够纯。因此使用前应该进行纯化(常用方法:蒸馏)。对于“专为合成DNA纯度”的溶剂也要检查其颜色(几乎所有的液体都是无色的)及透明度(颗粒将阻塞多孔玻璃,分子筛尘埃将造成合成失败)。大多数有关的杂质是水、酸、碱和金属离子。
水:对吸收水的化学试剂蒸馏一次,大多数溶剂的水分将会减少到10btg/g或更少。因为在偶联步骤中允许少量水的存在,故这种水分含量的溶剂可用于合成。许多溶剂都是吸潮的,因此所有溶剂的容器都应该塞紧,只能短时打开,通常没有必要在氩气中储存。
酸和碱:氯化的碳氢化合物常含有微量盐酸,在合成期间会使二甲氧基三苯甲基损失。通过下列方法可以进行检测:在5ml溶剂中溶解lmg的5,—O—二甲氧基三苯甲基脱氧核糖核苷酸衍生物,测定495nm处的吸收值,应该没有吸收。极性溶剂中的一级和二级氨能切断寡核苷酸与载体之间的键,可以用茚三酮试验检测。
金属离子:虽然溶剂中没有这一问题,但作为干燥剂的分子筛含有大量的铁。有些溶剂从分子筛中滤出三价铁离子,这种分子筛与DNA键合,引起碱基修饰和核苷酸间的切除。其他金属离子可能也是有害的。
2.试剂
DNA合成时,脱氧核糖核苷单体中小量的高反应活性的杂质造成的影响非常大。应用大量过量单体,扩大了杂质的影响。检测比较困难,但应该引起高度注意。在催化剂、偶联剂和脱保护剂中的杂质一般影响较小。
3.仪器
DNA合成可以用很多不同类型的仪器进行,总的原则是既能应用于磷酰二酯法,也可用于亚磷酰胺三酯法。仪器一般分为4种类型:手动、半手动、半自动化和自动化(DNA合成仪)。DNA合成仪减少了合成所需的手工劳动,但是仪器并不能取代人,机器的错误是随着仪器本身的检察能力而变化的。甚至的仪器都还没有能够准确地分析一个合成的成功与否或者根据提供的信息作调整的“反馈控制”。因此仪器并不是真正的“自动”(注意:测量释放的DMT基团仅仅是一种机械的检查,对可获得的产物量不是可靠的指导,只是对链扩增的效率有指导作用)。总之,无论选择哪种类型的仪器,接触溶剂的部分选用玻璃或是聚四氟乙烯材料。
 




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