神经胶质细胞培养实验
酶消化法
胰蛋白酶消化法
| 实验方法原理 |
胶质细胞具有复杂多样的结构和表达丰富的分泌产物，它含有大部分神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体、离子通道、神经活性氨基酸亲和载体、细胞识别分子，并能分泌多种神经活性物质(生长因子、神经营养因子和细胞因子等)。 神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。 |
|---|---|
| 实验材料 | 大鼠 |
| 试剂、试剂盒 | MEM FBS 胰酶 EDTA D-Hanks’液 |
| 仪器、耗材 | 眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 |
| 实验步骤 |
1. SD 大鼠经低温麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks’液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。
2. 剪碎组织成1 mm3 大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的 MEM＋10%FBS(Glial Medium，GM)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 吸出组织转移到另一支装有冷的 GM 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2～3 次。
5. 所得上清于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度1.5×105/cm2 种入 25 cm2 培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3 d 进行全量换液。
6. 摇床振摇分离星形胶质细胞和少突胶质细胞：培养至7～10 天，换液后放入孵箱继续培养24 h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280 rpm 摇 动18 h。此时寡突胶质细胞 90%以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。
7. 分离培养悬液内的少突胶质细胞：吸出悬液至离心管内950 rpm 离心10 min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×105/cm2 种入预先用100 µg/L 多聚赖氨酸包被好的 35 mm 培养皿培养。24 h 后换成DF12＋N2 的无血清 培养液，此后每三天半量换液1 次。
8. 瓶底星形胶质细胞的继续培养：25 cm2 培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks’液洗2 次后常规传代，以 1.5×105/cm2 种入预先用100 µg/L 多聚赖氨酸包被好的35 mm 培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1 次。附GFAP鉴定星形胶质细胞图片。
展开 |
| 注意事项 |
做原代混胶细胞，相对来说比较好养。
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