使用阿片类药物进行超高效合相色谱检测条件的...（一）
使用阿片类药物进行超高效合相色谱检测条件的系统方法开发
APPLICATION BENEFITS
■ 系统UPC2
■方法开发策略
■反相色谱的备用选择
■分析速度快
■出色的极性分析物保留性能
■“绿色”流动相
沃特世解决方案
ACQUITY UPC2™ 系统
ACQUITY UPC2色谱柱
ACQUITY® TQD 质谱仪
MassLynx® 软件
关键词
阿片类药物，疼痛管理，UPC2/MS，方法开发，UPC2，合相色谱
简介
超高效合相色谱(UltraPerformance Convergence Chromatography™, UPC2™)是一种创新型技术，它将UPLC®的优势充分应用至超临界流体色谱(SFC)。UPC2是一种与UPLC正交的分析技术，可将具有高扩散系数的可再生“绿色”溶剂CO2与多种互补型固定相结合使用，用于解决常规LC或GC分析遇到的众多分离难题。由于多数分析化学家们对UPC2缺乏足够的认识，因此有必要为UPC2方法的开发和优化提供直接的开发策略。
本文将UPC2应用于一组天然和合成阿片类药物的分析，演示UPC2方法的开发过程。这些化合物代表一类重要的临床药物。其相关应用包括实验室药品检测、疼痛管理监测和药物治疗方案的合规性。除大约25年前出版的一份报告外，1 我们未曾发现应用SFC分析阿片类药物的任何报道。因此，我们决定通过分析这类重要化合物来评估UPC2
的实用性。
本应用纪要重点突出了4种不同市售固定相结合4种不同有机辅助溶剂的系统性方法开发策略，该策略可快速确定方法开发的最优初始条件。经过初期筛选，最终通过直接快速的方法优化建立了一种针对19种天然、半合成和合成阿片类药物及其相关药物的分析方法，该方法可用于疼痛管理、成瘾治疗和药物滥用监测。最终方法能够在2 min内完成所有化合物的分析，并获得可接受的峰形，总循环时间为4 min。
实验
样品描述
19种经筛选过的化合物列于表1中，构成一组综合性实验药物组，包括用于疼痛管理的天然阿片类药物、半合成阿片类及合成麻醉性镇痛化合物。这些化合物多数为弱碱性，其pKa值大约为8-9。它们的极性范围较广，LogP值涵盖羟吗啡酮的0.78至美沙酮的5.0，如表1所示。MRM多反应监测转换见表1。所有化合物的储备溶液均用甲醇制备，工作溶液则以甲醇或异丙醇或乙腈/甲醇(60:40)为溶剂。工作溶液中所有化合物浓度均为500
ng/mL。
UPC2条件
系统：ACQUITY UPC2
色谱柱： ACQUITY UPC2BEH，2.1×50 mm，1.7µm (p/n 186006558)
柱温： 55 ℃
进样体积： 2µL
流速： 1.5 mL/min
流动相A： CO2
流动相B： 含0.4%甲酸和40 mM NH4COOH的甲醇
样品瓶： LC/MS认证的12×32 mm螺口最大回收(p/n 600000749CV)
梯度： 初始条件为2%的流动相B。流动相B在2 min内增 加至50%，达到50%后保持0.5min。然后在0.1min内流动相B返回到2%，重新平衡系统1.4 min。整个循环时间为4.0 min。
MS 条件
质谱仪： ACQUITY TQD
补偿泵流速： 含1%甲酸的甲醇(0.25 mL/min)
电离模式： ESI+
采集模式： MRM(请参阅表1了解离子跃迁)
毛细管电压： 1 kV
碰撞能量： 针对各化合物优化
锥孔电压： 针对各化合物优化
数据管理： MassLynx软件
结果与讨论
初始条件筛选
本实验利用色谱柱管理器考察4种不同化学性质填料的色谱柱和4种不同的辅助溶剂，对一系列的运行条件进行了筛选，确定出使用UPC2分析阿片类药物的最佳起始条件。所用色谱柱分别为Waters® UPC2BEH、BEH
2-EP、CSH™氟-苯基和HSS C18 SB。流动相B为甲醇，加有以下添加剂：无(仅甲醇)、0.2%甲酸、0.2%
NH4OH或0.2%甲酸+20 mM NH4COOH。初始筛选实验的梯度由5%的流动相B开始，在4 min内从5%增加至75%。然后在1
min内返回到5%，并在初始条件下重新平衡色谱柱1.4 min。每根色谱柱的流速设置为确保系统反压保持在6000
psi限值以下，BEH和2-EP色谱柱的流速为1.5 mL/min，HSS和PFP CSH氟-苯基色谱柱流速为1.0
mL/min。初始条件筛选实验采用包括芬太尼、吗啡、羟吗啡酮、羟考酮和美沙酮在内的几个化合物进行。这几个化合物代表一系列的极性范围，可简化初始筛选过程。
在BEH色谱柱上对添加剂进行的初步评价结果见图1。所有化合物浓度均为500ng/mL。谱图清楚的显示：采用纯甲醇和在甲醇中添加0.2%的甲酸时，羟考酮、羟吗啡酮和吗啡的MS峰形较宽，且峰强度偏低。相反，当以0.2% NH4OH或0.2%甲酸+20mM NH4COOH为添加剂时，多数化合物(本次初始筛选所用化合物)的峰形均可接受。在碱性条件下，分析碱性化合物可获得良好的色谱性能，这在SFC条件下分析阿片类药物表现尤为明显，上述结果与已有的报道相一致。1,2通过对下方的两张色谱图仔细分析可知，采用缓冲盐添加剂相比仅以浓氨水为添加剂可获得更好的保留性能和峰形。
