反向PCR
实验方法原理 标准 PCR 技术应用于定位在两个引物之间（指向内部）的一段 DNA 片段的扩增。与此相反，反向 PCR (inverse PCR) 应用于扩增和克隆与已知 DNA 序列某一个末端相邻的侧翼的未知 DNA 序列，这种未知序列没有引物可以利用。该项技术由几个研究小组开发（Ochmanetal. 1988; Triglia et al. 1988; Silver and Keerikatte 1989)，包括对含有已知序列以及侧翼区域的基因组 DNA 样品用一种在靶序列中无切点的限制性内切酶消化；酶切片段（如果是总的哺乳动物基因组 DNA，这种酶切片段往往有成千上万种）依靠分子内部连接发生自身环化；然后用这种自身环化的 DNA 作为 PCR 扩增的模板。实验用一对与已知序列的两端特异性结合的引物，通过二个方向向夹在中间的未知序列区域扩增。
实验材料 噬菌体 T4 连接酶限制性内切核酸酶热稳定 DNA 聚合酶寡核苷酸引物模板 DNA
试剂、试剂盒 扩增缓冲液ATP氯仿dNTP 贮存液乙醇酚氯仿乙酸钠TETris-Cl
仪器、耗材 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶屏蔽型枪头离心管正向排液式移液器PCR 仪
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
10X 扩增缓冲液
ATP ( 10 mmol/L )
氯仿
4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)
乙醇
酚：氯仿（1：1，V/V)
乙酸钠（3 mol/L）
TE ( pH 8.0)
Tris-Cl (10 mmol/L，pH 7.6)
2. 酶与缓冲液
噬菌体 T4 连接酶（1 单位/μl）
限制性内切核酸酶
热稳定 DNA 聚合酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶
4. 核苷酸与寡核苷酸
寡核苷酸引物1 ( 20 μmol/L) 和寡核苷酸引物2 ( 20 μmol/L）溶于水中
模板 DNA 溶于 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，内含少于 0.1 mmol/L EDTA
5. 特殊设备
自动微量移液器的屏蔽型枪头
离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）
正向排液式移液器
PCR 仪
二、方法
1. 设计和合成寡聚核苷酸引物 1 与引物 2 是根据已知的 DNA 序列。
2. 消化 2~5 μg DNA 模板（序列复杂度小于 109 bp）应用适当的限制性内切核酸酶。抽提这种酶切消化的 DNA 样品，应用酚: 氯仿和氯仿各抽提样品一次；用 2.5 倍体积的乙醇沉淀 DNA 样品，再加 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠；高速离心回收沉淀的 DNA 样品；沉淀用 TE ( pH 8.0) 溶解，使 DNA 样品的浓度为 100 μlg/ml。
3. 用一只 0.5 ml 灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板，依次加入以下连接反应试剂，内含浓度范围在 0.1~1 μg/ml 的酶切消化的模板 DNA 样品：
模板 DNA 10 ng~100 ng
10X 连接缓冲液 10 μl
1 单位/μl 噬菌体 T4DNA 连接酶 4 μl
10 mmoI/L ATP 10 μl
H2O 补足至 100 μl
反应管在 16℃ 水浴上放置 12~16 h。
4. 用酚: 氯仿和氯仿备抽提连接反应液 DNA 样品一次。用 2.5 倍体积的乙醇和 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠沉淀 DNA 样品。用高速离心回收沉淀的 DNA 样品，用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6) 或水溶解 DNA 样品。浓度配制成 100 μg/ml。
5. 用一只 0.5 ml 薄壁离心管，依次加入如下试剂，混合：
10X 扩增缓冲液 5 μl
20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（pH 8.0） 1 μl
20 mmol/L 寡核苷酸引物1 2.5 μl
20 mmol/L 寡核苷酸引物2 2.5 μl
1~5 单位/μl 热稳定 DNA 聚合酶 1.0 μl
H2O 28~33 μl
已环化 DNA 模板 5~10 μl
总体积 50 μl
6. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层加一滴矿物油（约 50 μl）防止样品在 PCR 反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。另一种方法是，如果应用热启动 PCR 程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置扩增离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。按以下方法进行 PCR 扩增。典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应）；
