大肠杆菌杂交及基因定位
一、原理
大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株（Hfr）的染色体上整合有F因子，当Hfr细菌与F－细菌细胞发生接合（即杂交）时Hfr细胞（供体菌）的染色体从Hfr细胞向F－细胞内转移。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中断，因此根据结合后F－细菌（以重组子形式选出）中Hfr细菌染色体基因出现次数的多少，即可得知基因转移的先后顺序，也就是说基因在染色体上排列的顺序。转移时，靠近转移起始点的染色体基因进入F－细胞的机率大，重组频率高，远离转移起始点的基因进入F－细胞的机会少，重组率低，F因子大部分位于转移起始点相对的一端（末端）。因此转移的频率很低。只有当接合时间很长，足以使整个染色体转入F－细胞（受体）时，才会使F－细胞转变为Hfr或F＋状态。
基因定位时首先要从Hfr与F－细菌的混合培养物中筛选出某一Hfr与F－细菌基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子中逐个测定其它的Hfr基因（非选择标记）出现的次数。Hfr菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以100％的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因，则以低于100％的频率出现在重组子中。F－细胞的选择性标记应起到排除Hfr菌生长的作用（即反选择）。本实验使用的F－菌株为Strr,
Hfr菌为Strs,借此可排除Hfr菌的生长。另一方面为保证Hfr基因有机会出现在重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使Hfr菌株有较高的接合频率，F－细菌应该过量以保证每一个Hfr细菌都能与F－细菌接合（10～20：1）。
二、目的
通过本实验，了解大肠杆菌杂交及其基因在染色体上的排列方式，并掌握大肠杆菌接合及染色体基因定位的原理与方法。
三、材料、试剂与器具
1、受体菌：FD1004 F－leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT strr rifr。
2、供体菌：CSH60 Hfr sup strs。
3、生理盐水：0.85%NaCl。
4、10×A缓中液。
5、基本培养基。
6、LB培养基。
7、选择培养基[B]—[G]：基本培养基加氨基酸（表1－2）。
8、培养皿、三角瓶、吸管、灭菌牙签、摇床、酒精灯、接种环。
四、操作步骤
1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和受体菌于5ml LB培养液中，37℃振荡培养10－12小时。
2、第二天清晨，各取1ml过夜培养物，分别加入到2个盛有5ml LB培养液的250ml三角瓶，37℃振荡培养2－3小时。
3、吸取0.5ml供体菌和4.5ml受体菌，加入到一个无菌的250ml三角瓶中混合，置37℃摇床上培养100分钟。
4、将上述接合菌液用生理盐水稀释100、10-1、10-2倍。
5、各吸取0.1ml稀释液涂布在选择培养基[A]平板上，每一种稀释液涂布2个平板。同时将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂布在[A]上作对照，每种各2个平板。此后均于37℃条件下培养48小时。
6、第四天，1）观察和计数选择培养基[A]平板上接合组和对照组的菌落生长状况；2）在与平皿相同大小的白纸上画100个小格，将圆片贴于选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然后用灭菌牙签从接合组选择培养基[A]平板上随机挑选100个菌落，对号点种在选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100个小格中；3）将所有平板置于37℃箱内培养48小时。
7、第六天，统计在各种选择平板上生长菌落的数目，记录于表1－1中。并绘制出基因顺序图。
表1－1 各选择培养基上生长的菌落数目统计
| 重复次数 |
[B] arg |
[C] trp |
[D] his |
[E] lac |
[F] gal |
[G] rif |
| 1 | ||||||
| 2 | ||||||
| 3 | ||||||
| 4 | ||||||
| 5 | ||||||
| 6 | ||||||
| 总数 | ||||||
| 平均数 | ||||||
| 重组率* |
表1－2 选择性培养基附加成份表
|
培养基 编号 |
选择性 标记 |
基本 碳源 |
基本培养基（A）中补充物质 | ||||||||
| str | rif | arg | ilv | met | leu | ade | trp | his | |||
| A | Met leu str | 葡萄糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| B | (met leu str)arg | 葡萄糖 | ＋ | － | － | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| C | (met leu str)trp | 葡萄糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | － | ＋ |
| D | (met leu str)his | 葡萄糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | － |
| E | (met leu str)lac | 乳糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| F | (met leu str)gal | 半乳糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| G | (met leu str)rif | 葡萄糖 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
