CPSA分会：LC-MS在生物分析中的应用
2012年4月25~27日，第三届中国上海化学与药物结构分析会议 (CPSA Shanghai 2012)在上海浦东新区淳大万丽酒店召开，来自国际知名药企、跨国大制药公司、中国CRO、生物医药研究所和高校的高管、专家、学者百余人参加了本次会议。其中在4月25日的分会上，举行了有关LC-MS在生物分析应用中的研讨会，来自Johnson and Johnson(强生)公司的Wenying Jian女士和Naidong Weng先生，来自(WuXi APPTEC)药明康德公司的Rorbert Coldreck先生分别做了相关的报道。
大会现场
Johnson and Johnson(强生)公司的Naidong Weng先生
首先，做报告的是来自Johnson and Johnson(强生)公司的Naidong Weng先生带来的报告是“Overview of GLP principles and key elements of bioanalytical method validation”(GLP原理的综述和生物分析方法验证的关键要素)。
Naidong Weng先生首先讲到良好的实验室规范研究，得到了毒理学研究(毒代动力学，TK)的支持，得到了其他药物的安全性相关研究的支持。而在非GLP的研究中，GLP原则仍然应用于许多研究领域，如临床研究中的生物等效性、生物利用度和新药的应用，和生物分析方法验证等方面。GLP的评价标准是衡量一个实验室设施合理性的重要工具，并确保数据完整性。Naidong Weng先生指出，GLP是受到了行业的生物分析方法验证的指导，欧洲药品管理局(EMEA或EMA)生物分析方法验证指引，定量生物分析方法验证，ICH的验证分析程序，药品质量体系等影响的。
另外，Naidong Weng先生还为大家报告了生物分析方法验证的关键要素。在这里他介绍了定量下限(6个数量级)、LLOQ(定量下限)下的信噪比，准确度和精密度等在生物分析方法验证中的影响。他还指出：在建立的回归模式中，LC-MS/MS检测方法在很大的一段浓度范围内都产生线性响应，且回归拟合合理、重复性良好。
在接下来的报告中，Johnson and Johnson(强生)公司的Naidong Weng先生还带来了“Technical considerations for bioanalytical method development, sample analysis, and trouble-shooting”(生物分析方法开发、样品分析及故障排除过程中的技术因素)。他从生物分析方法的生命周期、方法因素、样品的制备和色谱分离等几个方面做了详细的讲解。
Naidong Weng先生指出生物分析方法的生命周期是从方法的开发到方法的验证，再到方法的完善，最后是样品分析。方法思路中的样品制备方法有蛋白质沉淀法、液相萃取法、固相萃取法和在线分离等方法，色谱分离包括反相柱(C8，C18)、离子交换、离子对、HILIC柱和正相柱，检测方法包括MS、MS/MS、HRMS等。
Naidong Weng先生说：样品的制备是为了消除干扰、消除并减少杂质的影响、富集目标物并提高其检出限。他还道出了分离的重要性，如葡萄糖醛酸和谷胱甘肽共轭共轭代谢产物需要从分析物中分离出来，因为他们会打破待测源，造成分析偏差;异构体、等压同位素和内源性物质的干扰在分析中需要排除;磷脂和配料载体如PEG400的物质，需要从分析物中分离出来，否则他们会可能导致离子抑制。最后，Naidong Weng先生还讲述了利于色谱分离的方法：更高的柱效(高塔板数和低塔板高度)，当在高流速的情况下，较小的粒径的柱子可以提高柱效(正如在高倍压情况下，UPLC就会发挥相应的作用);更好的色谱分离峰(高的峰容量)，这与柱子的本身的分离性、固定相的物质、流动相的组成、和有效的优化柱子有关，这也需要色谱和分子好的维护。
(WuXi APPTEC)药明康德公司的Rorbert Coldreck先生
接下来的报告是来自(WuXi APPTEC)药明康德公司的Rorbert Coldreck先生，他报告的题目是“Practical considerations and preparations for bioanalytical laboratory audit and inspection”(生物分析实验室的审计和检查工作中的实际因素和准备工作)。
关于GLP
首先，Rorbert Coldreck先生首先讲了生物分析实验室中GLP标准，GLP包括临床的和非临床的研究。其中在临床研究中，需要具体的临床试验协议、BA实验室协议和报告、QA的参与和研究主任(BA的员工)。非临床研究中，需要具体的研究协议、测试设备时的研究主任、主要研究者(PI)和有贡献的科学家(CS)、PI/CS的报告和QA的参与。Rorbert Coldreck先生还举了一些例子来叙述生物分析实验室的GLP标准。
之后，Rorbert Coldreck先生对GLP的检查过程中的检查形式、分类、管理行政行为一一做了分析。
GLP检查的准备工作
GLP检查的准备工作包括设备的准备，如检阅组织结构图、加强检验过程等;需要注意的地方有工作台的干净整洁、标签时准确完整的、文件审查是当前的等等;监管检查时可以做的和不能做的：要采取一个友好合作的态度、要诚实、回答问题时要简洁，不要猜疑、撒谎、紧张，更不要说可能或没有发生的事情;开展GLP检查，建立初次的接触与督察，协调计划的检查，提供要求的文件等。
容易不符合规定的部分有：分析结果没有文件;药物样品的接收和处理的不足或没有书面程序;所有的数据点已经失效，或者可以以不记录在案，作为一个科学合理的理由拒绝;非技术人员进行分析程序;样品被允许长时间的不正确储存等等。
Johnson and Johnson(强生)公司的Wenying Jian女士
来自Johnson and Johnson(强生)公司的Wenying Jian女士带来了，“Special considerations for LC-MS bioanalysis of proteins and peptides”(生物质谱技术在分析蛋白质和多肽时的特殊解决方案)
Wenying Jian女士在会上提到，质谱技术分析蛋白和多肽时，分为三个步骤，分别是样品的制备、液相分离和质谱检测。
在样品的制备过程中常用到的方法有PPT法、固相萃取法、丰富的蛋白质消耗、免疫亲和富集和消化等方法。一般情况下，当血浆中的蛋白质或肽链MW<10,000Da时，使用PPT法和固相萃取法;当蛋白质或肽链MW>10,000Da时，使用丰富的蛋白质消耗和免疫亲和富集，然后再消化的方法。
在液相分离过程中常用的方法有反相高效液相色谱、HILIC色谱柱分析法、单片、熔芯、离子交换、2D-LC、上线萃取等方法。在一般情况下，给目标肽链或蛋白质定量时，C18柱用于小的肽链，C12、C8柱用于大的肽链，C4柱用于蛋白质。当希望从较多干扰物中较好的分离时，可以使用2D的方法。
在质谱检测中，一般会使用MRM做标志的肽链和完整蛋白质，MS用于完整蛋白质的分析，还有MRM3等方法。Wenying Jian女士讲到质谱分析中面临着很多挑战，如质荷比值可能超出仪器的检测限;多带电方式和广泛的同位素分布限制了其灵敏度;在电离效率下高度的变异性和不同的带电状态下的分布情况;解离效率差等等。
最后，Wenying Jian女士表示目标蛋白质或肽链的样品制备过程是个瓶颈;在整个肽链或蛋白质分析过程中，最好使用稳定的同位素标记物作为内标物;特别需要注意的细节有吸附、稳定、溶解度、PTM、特定蛋白结合等过程。
随后，Wenying Jian女士继续为大家讲解了“Challenges and solutions for LC-MS analysis of biomarkers”(液质联用技术分析生物标志物的挑战和解决方案)。
首先，Wenying Jian女士向大家阐述了生物标志物的定义，她说：“生物标志物作为一项指标，在正常的生理过程、治病过程、干预治疗的药理反应客观的测量和评价过程中，具有至关重要的作用。”
生物标志物的生物分析方法
生物分析检测中，STD和QC样品理想中的制备方法，是使已知数量的待测尖峰信号进入到预定的生物基质中去。然而，对于内源性化合物，生物基质本身通常包含一个未知的待测物质，这使得它不适合参与样品的制备了。克服这个问题的方法可以是：分析物本身，基质本身;分析物本身，基质替代物;基质本身，分析物替代物;或者是酶活性的测定。
“Fit-for-purpose”
目前，有没有监管指导生物标志物检测验证和实施。“Fit-for-purpose”是共同为业界采用小分子生物标志物检测的指导和PK研究的白皮书。其中它有很多方法是得到了共识的，它作为生物标志物的数据，使用越来越先进的临床或其他关键业务的决策增加验证使用;严谨的验证，提高了作为生物标志物的数据使用越来越先进的临床或其他关键业务的决策;数据显示准备申请检测的可靠性。
“Fit-for-purpose”的原理来源于纳入或排除的验证实验、灵活的实验设计、扩大或缩紧验收标准。
在会后的问答环节中，与会者踊跃提问，现场气氛十分热烈。
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