免疫球蛋白提取技术（二）
4、禽血清IgG的分离与提纯（Na2SO4法）
（1）试剂
①5%葡聚糖硫酸盐
②0.02Mol/L MnCl2溶液
③无水硫酸钠
④pH8.2硼酸盐缓冲液
⑤0.06Mol/L pH7.4PB液
（2）操作方法
①取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。
②于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。
③以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。
④重复步骤③，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
⑤以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。
⑥过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。
⑦如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。
也可以按以下操作方法进行：
①以18%硫酸钠（W/V）提取一次，再以14%的硫酸钠提取一次。
②将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9%加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO42-为止。
③离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
④过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。
二、IgM的分离与提纯
1、材料
（1）血清
（2）葡聚糖凝胶G200
（3）洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris－HCl 0.14Mol/L NaCl）
2、操作方法
选取2.50cm×90cm层析柱，用葡聚糖凝胶G200装柱，平衡后，直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品，洗脱液洗脱，流速0.25ml/min，分管收集，测OD280值，第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合，浓缩、鉴定。
三、IgA的分离与提纯
1、材料与试剂配制
（1）DEAE52纤维素
（2）0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4•；7H2O 2.88g
加水至1000.00ml
（3）饱和硫酸铵溶液
（4）10%EDTA—Na
（5）SephadexG200
（6）0.01Mol/L pH7.4PB液
（7）0.10Mol/L pH6.4PB液
（8）血清
2、操作方法
（1）取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液，调pH至7.0，室温搅拌1h，离心去沉淀。
（2）于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置30min或冰箱过夜。
（3）10000r/min离心10min，去上清。
（4）取沉淀溶于4ml10%EDTA－Na溶液中。
（5）生理盐水中透析除盐。
（6）过DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白（IgG）弃去。
（7）换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。
（8）再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脱液测OD280值，取第一峰即为纯化IgA。
（9）透析、浓缩、鉴定。
四、分泌型IgA的分离与鉴定
1、材料与试剂
（1）初乳
（2）SephadexG200
（3）0.10Mol/L pH6.8PB液
（4）0.01Mol/L pH7.4PB液
（5）DEAE52
2、操作方法
（1）取初乳20ml，10 000rpm离心10min，弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。
（2）取乳清过SephadexG200柱（柱规格为2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱，第一峰为IgA（含IgG）。
（3）收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
（4）将透析液浓缩至5mg/ml以上。
（5）过DE52层析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱，洗下蛋白峰为IgG，弃去。
（6）换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脱，
收集洗脱液，即为较纯的IgA液。
（7）必要时，可再过一次SephadexG200柱。
（8）浓缩，鉴定
五、禽IgA提取与纯化
1、材料与试剂配制
（1）禽胆汁
（2）饱和硫酸铵溶液
（3）0.01Mol/L pH7.4PBS液
（4）0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）
（5）DEAE52-纤维素
2、操作方法
（1）取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25%饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
（2）3000r/min离心30min，去沉淀。
（3）取上清，加饱和硫酸铵液，使成35%的饱和度，4℃放置30min。
（4）3000r/min离心30min，弃上清。
（5）取沉淀，加0.85%NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。
（6）将沉淀用0.85%NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
（7）以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱（20×250mm）。
（8）取透析样品4ml（﹥20mg/ml蛋白浓度）加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
（9）再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl浓度为0.30Mol/L）洗脱，收集洗脱液。
（10）浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。
六、IgE的分离与提纯
1、材料与试剂
（1）血清
（2）饱和硫酸铵溶液
（3）洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液
0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液（0.14mol/L NaCl）
（4）DE52
（5）SephadexG150
2、操作方法
（1）取血清倍比稀释后，加等量饱和（NH4）2SO4溶液，盐析。
（2）离心取沉淀，溶于少量生理盐水中，透析、除盐。
（3）过DE52柱，以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱，收集洗脱蛋白峰（IgG），弃去。
（4）换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗下的蛋白峰主要是IgE。
（5）透析除盐。
（6）过G150柱，以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液即为纯化的IgE。
（7）浓缩、鉴定。
