280 纳米光吸收法测定蛋白质浓度实验
280纳米（A280）光吸收法
| 实验方法原理 |
由于蛋白质分子中常酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外 280 nm 波长处有最大吸收峰，其吸收值与蛋白质浓度成正比，故可用 280 nm 波长吸收值大小来测定蛋白质含量。 |
|---|---|
| 实验材料 | 待测蛋白质样品 |
| 试剂、试剂盒 | 实验用缓冲液（空白对照） |
| 仪器、耗材 | 分光光度计（配备紫外档） 石英比色杯 用于溶液转移的吸管和吸球 |
| 实验步骤 |
1. 单道分光光度计 1.1 将实验用缓冲液加入比色杯中 ，将 A280 值调至零。 1.2 吸去缓冲液对照加入样品，记录值 。 2. 双道分光光度计 2.1 将仪器调零。 2.2 将样品和对照分别加入样品杯和对照杯中，然后记录光吸收值。
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| 注意事项 |
1. 实验室中常犯的错误是认为用 1 cm 的比色杯所测光吸收值为 1.0 时，蛋白质溶液浓度大约为 1 mg/ml，这是非常不精确的。以下比较了不同的标准蛋白质在 1 mg/ml 时的光吸收值。 2. 这一技术被广泛用在柱层析时监测蛋白质洗脱峰的出现，但是除非使用更特异的方法，A280 值并不能代表洗脱蛋白质的量，可使用快速和灵敏的蛋白质定量方法如 Brad-ford 或蛋白质点杂交结合测定法。 3. 玻璃和塑料在紫外吸收光范围内具有光吸收值，因而不能用来进行蛋白质的定量。 4. 如果所测值超过测量范围，应将样品用缓冲液吸收后再测量，或使用更小的比色杯来测量。 5. 如果实验所用的缓冲液和水相比有较高的光吸收值，这说明缓冲液中有感染物质存在。适度的缓冲液的光吸收值可通过调零来平衡。但是由于干扰物质的偏离光影响在高的光吸收值下，分光光度计的灵敏度范围变窄。 6. 修改测定方法可部分改正由于干扰物质和蛋白质组成不同所引起的误差，其中包括检测 A280/A260 的比值和 A280/A235 的比值。 7. 当有核酸存在时，可进行如下修正： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.5×A280 - 0.75×A260 8. 如果 A280/A260 约为 2，这时可忽略溶液中核酸的光吸收值。
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