显微操作技术在基因编辑中的应用（二）
图6：PN 注射过程DNA 随机非靶向整合到基因组中
典型的PNI系统设置：
-DMi8：手动、电动部件可供选择
-透射光轴； S28聚光镜及微分干涉差
-5/10倍物镜（FLUOTAR或N PLAN）用于大致观察
-20倍、40倍长工作距离物镜。40倍物镜用于注射
-3板载物台（固定载物台的物体导杆妨碍显微操作器！）
-精选显微操作器（优选直接注入的毛细管：平角有助于尽可能降低胚胎受损程度）
-气压式手动显微注射仪用于固定（逆时针转动产生的负压可固定胚胎）
- FemtoJet®显微注射仪（少量液体，压力x 时间 = 体积）
-根据实验室偏好选择样品载体（玻璃底器皿、盖玻片等）
PN注射通常在室温下借助放大400倍的微分干涉差显微镜（一些还使用IMC）完成。（一些情况下还将胚胎冷却至10°C，使质膜更僵硬以方便注射）
胚胎干细胞移植
胚胎干细胞注入囊胚（图4），囊胚阶段从第3.5天开始，约128个细胞。内细胞群由多能性胚胎干细胞组成，也就是说它们可以发育并分化为不同类型细胞。有时注入八细胞阶段的桑椹胚胎 （图9）。
图7：ESI。以固定的毛细管（左侧）固定小鼠胚囊。经由毛细管将基因修饰的胚胎干细胞注入囊胚腔（右侧）。注射在内细胞群外滋养外胚层细胞之间完成。图片以徕卡AM6000上的徕卡DIC采集。
注入的胚胎干细胞与内细胞的胚胎干细胞发育为小鼠。这是一只嵌合体小鼠，其细胞/器官来源于注入的胚胎干细胞（雄性）和胚囊（雄性/雌性）。
目的基因的编辑在胚胎干细胞移植注射前完成，这耗时大约3-4个月 ，直至携带基因组DNA靶序列的ES细胞克隆被选定。大部分时间里修饰只出现在一个等位基因，意味着嵌合体是杂合的。产生的克隆在1个等位基因上携带靶突变（在两个等位基因上的概率非常低）。这项技术允许插入大约10-20 kB的DNA。靶向突变所用方法为同源重组。
图8：ES细胞DNA的靶向整合/突变
1）利用分子生物学技术创建含有靶DNA以及新霉素抗性位点、翻转酶识别位点（FTR）和CRE重组酶识别位点（loxP）的DNA。
2）通过转染方式将靶DNA注入ES细胞。重组体通过同源重组整合到基因组DNA。
3）往细胞培养物中添加新霉素（一种抗生素），以选择产生的ES克隆。只有具备新霉素抗性的克隆才能存活生长。挑出这些克隆继续培养。
4）添加翻转酶（一种切割DNA并将其重新结合的重组酶），消除新霉素抗性。
5）通过转基因小鼠与另外一只转基因“CRE小鼠”交配，loxP位点可以条件性敲除。表达CRE重组酶的小鼠通常具有类似组织特异性的表达，这种特异性的表达使小鼠具备例如在大脑中的基因的靶向敲除。
经由同源重组及ES细胞注射的靶向突变，多年来已成为“金标准”。与CRISPR相比，不足之处包括：
载体准备时间长
选择ES细胞克隆费时
载体克隆和ES细胞工作耗时约3个月
生成纯合子小鼠耗时约1年
如上所述，在大约 99% 的案例中，产生的嵌合体是杂合的。最终目的是获得用于研究的纯合子动物。
这是一个费时费力的交配、筛选过程：
1) 胚囊（♀或♂）+ ES细胞（♂）产生♂嵌合体。目的是获得生殖细胞中具有ES细胞修饰的嵌合体
2) ♂ 杂合嵌合体 + WT ♀产生杂合F1（♂或♀）
3) 杂合♂ + 杂合♀ 产生纯合F2代
纯合子小鼠的两个等位基因上均携带突变。最终获得这些有价值的动物耗时1年左右！
典型的ES移植系统设置：
-DMi8：手动、电动部件可供选择；
-透射光轴；S28聚光镜
-DIC为非必需。胚胎在胚囊阶段已经足够大，其细节容易观察。
- 5/10倍；20倍；40倍长工作距离物镜；较小NA = 较大景深
-3板载物台（固定载物台的物体导杆妨碍显微操作器！）
-精选显微操作器（优选直接注入的毛细管：平角有助于尽可能降低胚胎受损程度）
-气压式手动显微注射仪用于固定
-油压式或油压式带齿轮手动显微注射仪用于注射ES细胞。
ES细胞注射通常在室温下借助放大200倍的DIC/ IMC/PH显微镜完成。
ESI的差异在于将 ES细胞注入8细胞阶段的胚胎中（图9）。这项操作通常使用钝端毛细管完成，以免损伤细胞。激光器（Hamilton-Thorne，Octax或Piezo压电式破膜系统）可帮助钝端毛细管穿过透明带和膜。
