酵母剪接体分析实验（二）
4. 设备
(1) 液氮 （N2）。
(2) 离心机，匀浆器，旋转真空浓缩仪。
(3) 各种试管、离心管。
(4) 玻璃板：一块为 26.5 cm 高、20.2 cm 宽、0.4 cm 厚。带凹口的玻璃板尺寸同前一块，但带一 2.2 cm 深、16.3 cm 宽的凹口。
(5) 聚四氟乙烯垫片和梳子：垫片和梳子厚度为 0.5 mm，梳子宽为 16 cm，高 2.7 cm，14 个齿，齿宽 8 mm，长 11 mm，齿间间隔为 3 mm。
(6) 黄色胶带。
(7) 电泳槽。
(8) 电源：能提供 200 V 电压和 50 mA 电流的电源，恒压。
(9) 微型脉冲蠕动泵或同类产品。
(10) 平头毛细管吸头。
(11) Whatman 3 MM 滤纸。
(12) 硬质玻璃盘或不锈钢盘（浸泡凝胶和洗 Nonhern 印迹用）：先用肥皂和水洗涤， 在 252℃ 干烤 4~5 h。然后用去离子水漂洗，空气干燥。
(13) 电转移装置：可同时放两块凝胶，该装置放在冷室中。
(14) 紫外交联仪：三个 15 W 的紫外灯管相互间隔 8.5 cm，离样品平面 35 cm。
(15) 微波炉或加热盘 ( hot plate)。
(16) 杂交袋和密封器。
(17) 水浴振荡器或杂交炉。
(18) X 射线片，压片暗盒，增感屏和胶片处理设备。
(19) 凝胶干燥器（可选）。
二、操作方法
1. 制备剪接体分析用竞争性 RNA
(1) 戴无尘手套以避免手上 RNase 的污染。
(2) 从 8~16 只小鼠取出小肠和肝脏。一次处死一只小鼠并取出它的小肠和肝脏。 操作时要避免取到胆囊和胰腺，因为这些器官富含核酸酶。取出的小肠和肝脏应立即置于液氮中，在 -70℃ 可保存过夜，在液氮中最多可以保存 1 年。
(3) 准备匀浆。室温下在一块干净的纸巾上解冻几块小肠。尽可能挤出小肠中的残留物，把小肠剪成 5.08~7.62 cm 的小段，将其转移至加有 10 ml 冰冷匀浆缓冲液的 50 ml 无菌的一次性聚丙烯离心管中。每只小鼠的器宫用 10 ml 匀浆缓冲液，如果缓冲液太少 RNA 的产量就会很低。肝脏可直接加到缓冲液中。
(4) 匀浆前，用 DEPC 处理水和乙醇洗涤匀浆头。一次可匀浆 20~30 ml 的样品，以中速对肝脏样品匀浆 1 min，小肠匀浆 30 s。匀浆时间要求并不严格，主要依匀浆的情况而定。匀浆液应该很稠，没有明显可见的组织块。结束后，匀浆液放在室温。
(5) 离心去掉残渣。匀浆液转移到离心管中，于室温、8500 g 离心 15 min 去掉残渣。
(6) 沉淀 RNA。把匀浆液转移到新的离心管中，避免吸到上清液上层的 1~2 ml 黏稠物和底部的残渣。匀浆液放在冰上于冷室中过夜（至少 6 h，最多 2~3 天）。用高速离心机于 4℃、11000 g 离心 15 min 以离下 RNA 沉淀。
(7) 溶解 RNA 并用有机溶剂抽提。用 2.5 ml 溶解缓冲液溶解 RNA 沉淀，并转移到一 corex 离心管中。戴上手套和防护镜，穿上防护服，加等体积苯酚到溶解的 RNA 中。涡旋混合水相和苯酚溶液，再用高速离心机于 4℃、11000 g 离心 10 min 分离水相和黄色的苯酚层，把含 RNA 的水相转移到干净的 Corex 管中。加 1 ml 新鲜的溶解缓冲液到苯酚层中，重新抽提，合并水相。用等体积新的苯酚重新抽提合并的水相。加 1~2 倍体积的氯仿：异戊醇到抽提出的水相中，涡旋混合，离心分离水相和有机相。把上层的水相转移到干净的 Corex 管中。
(8) 用醋酸钠和乙醇沉淀 RNA，加入 1/15 体积的 3 mol/L 醋酸钠（pH 5.4) 到水相中，然后加入 3 倍体积的无水乙醇，混合，干冰上放置 10 min 或 -20℃ 过夜。高速离心机上于 4°C 11000 g 离心，弃上清。室温下用 70% 的乙醇洗两次，吸出 70% 乙醇后，用干净的纸巾吸出剩余的乙醇。
(9) 溶解并重新沉淀 RNA。用冷水溶解 RNA，每个器官 0.25 ml，置于冰上。对于 16 只小鼠，每种器宫应有 3~4 ml 的 RNA 溶液。加 7.5 mol/L 醋酸铵到 RNA 溶液中，使其终浓度为 0.2 mol/L，混合后分成 400 μl 每个离心管。加 1.2 ml 无水乙醇到每管中，于 -70℃ 保存。
(10) 制备竞争性 RNA，在 4℃ 离心 2 或 3 管沉淀的 RNA（14000~15000 g，10 min)。室温用 70% 乙醇洗两次，并用旋转真空浓缩仪干燥沉淀。用小体积的水溶解 RNA 并合并 RNA，总体积约为 100~150 μl。测出 RNA 的浓度和纯度（取出少量，稀释 500 或 1000 倍，测出 λ260 和 λ280 处的光吸收值，λ260 1OD 相当于 40 μg/ml RNA)。竞争性 RNA 的母液浓度应为 20~30 μg/μl。OD260/OD280 高于或等于 1.6 时，RNA 可用于分析实验。这种溶解的 RNA 于 -70℃ 可保存两年。
2. 灌制非变性凝胶
(1) 清洗玻璃板、梳子、垫片和硅烷化处理带凹口的玻璃板，不要硅烷化另一块玻璃板，否则电泳后分开玻璃板时会破坏凝胶。
(2) 把玻璃板和垫片安装在一起，把无凹口的玻璃板平放，并放上垫片，垫片的一端与凝胶的底部平齐，把带凹口的玻璃板放在上面，硅烷化的一面朝里面，从顶部到底部夹紧，用黄色胶带包住两块板的底部及两侧，去掉夹子。
(3) 灌制凝胶。把装好的玻璃板放在吸水纸上，稍微倾斜以减小灌好后凝胶的静力学压力。配制一块或两块 3.2% 的凝胶，按顺序加下列物质到 150 ml 的无菌烧瓶中：61.5 ml 室温的水，4.8 ml 17X TP8，12.8 ml 丙烯酰胺储存液。轻轻搅拌并慢慢加入 120 μl 1 mol/L 的乙酸镁，120 μl TEMED 和 660 μl 10% APS。把混合液倒进两块玻璃板形成的槽中直至液面到带凹口玻璃板的顶部，插上梳子，使每个齿全部浸在凝胶中。螺丝钳夹紧使玻璃板和梳子压在一起，再倒一些凝胶在梳子上。让凝胶在室温聚合 1~4 h。
(4) 开始剪接反应前至少 1 h，在冷室中把凝胶装在带循环泵的电泳槽中。倒入电泳缓冲液，使玻璃板底部浸入 2.5 cm，凝胶顶部浸入至少 1 cm。安装并使蠕动泵的两个管子与底部和顶部缓冲槽相连，使缓冲液从底槽向顶槽循环。用缓冲液轻轻地冲洗加样孔。上样前 160 V 预电泳半小吋，开始电流为 12.5 mA，然后降到 11 mA 并保持恒流。
3. 基本剪接体的分析
(1) 准备加有 R 缓冲液和竞争性 RNA 的小管。加 6 μl 竞争性 RNA 储存液（20 μg/μl）到 60 μl R 缓冲液中，混合后各取 8.3 μl 分别加到 6 个 1.7 ml 的离心管中，离心管放在冰上。
(2) 按照顺序在离心管中加入下列溶液以准备剪接反应（在冰上)：13.8 μl H2O，1 μl 100 mmol/L DTT，3 μl 1 mol/L 的磷酸钾盐缓冲液，5.0 μl 30% PEG8000，1.5 μl 0.1 mol/L MgCl2，1 μl 100 mmol/L ATP，20 μl 完整细胞提取物，混匀后离心 2 s。对于 0 时间点的样品，取出 6.5 μl 反应混合物加到含 R 缓冲液和竞争性 RNA 的第一管中，冰上放置（放射性标记的前体 mRNA 以后要加到此样品中）。
(3) 起始和终止剪接反应。反应混合物在 23℃ 水浴中放置 2~3 min，然后加入 5.5 μl 放射性标记的肌动蛋白前体 mRNA。反应体系中各成分的浓度分别为：60 mmol/L 磷酸盐，3% (m/V) PEG6000，3 mmol/L MgCl2，2 mmol/L ATP，20 mmol/L KCl，8 mmol/L HEPES，80 μmol/L EDTA，2.2 mmol/L DTT，8% ( V/V) 甘油，0.4 nmol/L 前体 mRNA，40~80 μg 提取物。加入放射性标记前体 mRNA 后，每 1 min 取出 7.5 μl 反应液依次加到含有 R 缓冲液和竞争性 RNA 的离心管中，样品（R 缓冲液和竞争性 RNA 中）保持在冰上，让最后取出的样品（R 缓冲液和竞争性 RNA 中）在冰上孵育 10 min，同时加 1 μl 放射性标记的肌动蛋白前体 mRNA 到 0 时间点的样品中，10 min 后，加 4 μl 冰冷的上样缓冲液到每管样品中，迅速混匀，冷室中离心 2 s。样品上样前一直要放在冰上。
(4) 上样、电泳。上样前关掉电源和循环泵，快速冲洗加样孔，但加样孔之间的凝胶条要保持直立。用平头的微量吸头每个样品吸 15 μl，吸头伸到加样孔底部加样，要避免碰到孔中的样品。150~160 V 电泳 14~22 h，电泳 30 min 到 1 h 后打开循环泵使缓冲液循环流动。
(5) 取出凝胶。取凝胶前，剪两张和无凹口玻璃板一样大小的 Whatman 3 MM 滤纸，放在旁边。关掉电源和循环泵，室温拆下电泳装置，去掉胶带和垫片，小心取下带凹口的玻璃板，凝胶会留在无凹口玻璃板。然后把一块 3 MM 滤纸放在凝胶上，戴手套轻压使 凝胶紧紧地和滤纸相连，在上面再放一张滤纸，翻转带凝胶的玻璃板，取下玻璃板，用滤纸托住凝胶。
(6) 使凝胶对 X 射线片曝光。用塑料膜（plastic wrap) 包住凝胶和滤纸，在 -70℃ 对 X 射线片曝光 ( 需增感屏）。凝胶可解冻/冻结数次，对几张 X 射线片曝光。曝光后，凝胶可冻存在 -20℃ 用于以后的操作（干燥或把 RNA 转移到尼龙膜上）。
(7) 多次曝光或对磷光板曝光，使凝胶中的 RNA 沉淀并使凝胶干燥。去掉塑料膜和第二张滤纸，用足量的 15％ 甲醇和 5% 乙酸浸泡与一张滤纸结合的凝胶，室温缓慢地振摇 20 min。凝胶和滤纸会分离，但一去掉固定液，二者就会结合。用带真空泵的吸管慢慢吸掉固定液，戴手套轻轻地把凝胶和滤纸转移到两张的 3 MM 滤纸上。在凝胶干燥器中于 60℃ 干燥 45~60 min。
(8) 清洁电泳槽。电泳时，缓冲液槽的铂丝会结上沉淀，擦拭并用去离子水冲洗以去掉沉淀，空气干燥。
4. Nonhern 印迹分析内源性 snRNP 复合物
(1) 采用非变性电泳分析 RNA 结合蛋白时通过预实验确定使 RNA 复合物同其他的未结合的因子有效分离的最佳条件是非常有必要的。如剪接依赖复合体中的前体 mRNA 能通过 Northern 印迹与非结合的 snRNP 分开。在最初的实验中，剪接依赖的复合体可以被放射性标记的前体 mRNA 示踪，而非结合 snRNP 的位置可通过与 snRNP 特异探针的杂交来确定。在随后的实验中确定哪种 snRNA 存在剪接依赖复合体中，在非变性凝胶分析中采用有很低或没有放射活性的转录物，但用于 Northern 印迹的凝胶处理则与这里所介绍的一样。
(2) 处理凝胶 ( 使其适合转移 RNA 到膜上）。凝胶对 X 射线片曝光后，去掉塑料膜和第二张 3 MM 滤纸，把与第一张滤纸结合的凝胶转移到盛有足量 1X TBE、8 mol/L 尿素的耐热玻璃盘中，液面高约 2 cm，室温慢慢摇动 15 min。小心地取出滤纸并用与真空泵相连的吸头吸掉液体，小心操作，以防破坏凝胶，加入新的 1X TBE，8 mol/L 尿素，再摇 15 min，同时剪 4 张和凝胶相同大小的 3 MM 滤纸，15 min 后，将两张 3 MM 滤纸托在凝胶下面，吸掉液体，保持盘面水平，使凝胶完整地放在滤纸上面。在 8 mol/L 尿素中浸泡对于 snRNA 和前体 mRNA 从复合体上高效地转移到膜上是非常重要的。
(3) 把凝胶和尼龙膜装在转移装置。让尼龙膜先在水中浸湿，然后浸没在 0.25X TBE 中。把凝胶、尼龙膜、滤纸等装在电转移装置上 ( 注意方向，以使 RNA 从凝胶转移到膜上）。
(4) 在 115~120 V 电压下转移 1 h。转移 1 h 后缓冲液的温度会升到接近 37℃。
(5) 使 RNA 和膜交联。拆下电转移装置，从膜上去掉滤纸和凝胶。用圆珠笔在膜上作一标记以显示转移时与凝胶接触的一面。迅速用新鲜的 0.25X TBE 漂洗以洗掉凝胶碎片，把尼龙膜放在一干净的玻璃皿上，带标记的一面朝上。用一层塑料膜包住尼龙膜和玻璃皿。避免让膜干燥，因为当膜是湿的时候 RNA 和膜最容易交联。把玻璃皿放在离紫外灯管 35 cm 处，打开紫外灯照射 12 min。
(6) 使膜对 X 射线片曝光以获得放射性标记前体 mRNA 的图像并检査转移效率。如果在反应中用了放射性标记的前体 mRMA，可以用自显影的方法检査转移的效率。让膜在空气中干燥 30~60 min，用一张 3 MM 滤纸托住尼龙膜，带标记的一面朝上。用一层塑料膜包住尼龙膜和滤纸，让它在 -70℃ 对 X 射线片曝光（放在压片暗盒中）。
(7) 在低盐和 SDS 中加热以对尼龙膜进行预处理。将 500~1000 ml 0.1X 印迹洗涤溶液加入一个硬质耐热玻璃盘中，用塑料膜盖上，在微波炉中煮沸。小心地把膜浸没在溶液中，盖上塑料膜，在微波炉（低热档）中煮 10 min。室温慢慢振摇 10 min。
(8) 预杂交。用两张和尼龙膜一样大小的 3 MM 滤纸夹住尼龙膜，一起放进一个于的杂交袋中，小心地取出滤纸，膜留在袋中。在杂交袋中加入约 20 ml 杂交液（没有探针）。把袋平放在桌面上，挤出全部气泡（气泡会阻止探针的杂交），然后封上杂交袋。在 42℃ 振摇水浴（慢摇）中孵育至少 1 h。
(9) 杂交探针的准备见实验材料部分。从水浴中取出杂交袋，切开一角，倒出杂交液。吸入含探针的杂交液，挤出气泡（重要），密封杂交袋。在 42℃ 振摇水浴中孵育 12~24 h。
(10) 洗膜。切掉一角，把杂交液倒进放射性废液罐中。把杂交袋平放在几块纸巾上 ( 下面垫上吸水纸），切开杂交袋，用平头镊子夹出杂交膜，放进一个装有 500 ml 3X 印迹洗液的硬质玻璃盘中。室温摇 10 min，把洗液倒进放射性废液灌中，重复洗涤两次。第四次洗涤加 500 ml 55°C 的 3X 印迹洗液，在 55℃ 水浴中揺 10 min。最后一次洗膜加 500 ml 55℃ 的 0.1X 印迹洗液，55℃ 水浴摇 10 min。
(11) 曝光。从洗液中取出杂交膜，用 3 MM 滤纸吸干，空气干燥 30 min~1 h。用一张 3 MM 滤纸托住杂交膜，带标记的一面朝上，用一层塑料膜包起来。放在压片暗盒中于 -70℃ 对 X 射线片曝光 12 h~5 天。
(12) 去掉探针并以另一探针杂交。杂交膜依次至少可和 6 种探针杂交。曝光后，可以用步骤 (7) 的方法去掉原先的探针。要检查探针去除的效率，可以在用下一种探针杂交之前让膜在空气中干燥，然后对 X 射线片曝光。
