Cas9-CKI小鼠繁育原则与路线讲解
随着基因工程技术的发展，针对特定基因研究的小鼠模型构建也越来越成熟。但是，构建成功的模型小鼠要用于实验，还需要漫长的繁育之路要走。行百里者半九十，你以为模型构建成功了就结束了吗？NO NO NO！繁育是提供合格实验材料过程中的临门一脚。
特别是对于CKO、CKI这些组织特异性的模型小鼠，需要与cre工具鼠配繁，才能得到在特定组织敲除或敲入的目的小鼠。而基于cas9[1]技术制作的CKI小鼠，对于不同的构建策略，繁育之路也是不同的。这一点需要涉及Cas9-CKI繁育工作的研究人员注意。否则，三周怀胎，一朝分娩，含辛茹苦到断乳，最终还是宝宝心里苦。
Cas9-CKI小鼠的构建过程分体外和体内两个阶段：
1.F0 代繁育原则：
1) 利用CRISPR/Cas9系统打靶获得到的小鼠，由于Cas9系统在受精卵阶段对基因进行编辑，在F0代可能出现多种基因型并存的状态。Cas9技术制作的小鼠不带有Neo标记基因，但是会产生多条line，F0要分line繁育。
2) 阳性F0代小鼠和野生型背景鼠回交后，所得到的后代基因型将会单一。
3) F0代小鼠之间不能相互交配。
2. F1代及F1代之后繁育原则：
1) 由F0代小鼠和野生型背景鼠交配得到的后代小鼠称为F1代。
2) 阳性F1代小鼠可用于保种建系。
Cas9-CKI小鼠的模型构建主要有2个策略，虽然繁育原理不同，但是其繁育路线大致相同；下面跟大家介绍一下两个不同构建策略制作的Cas9-CKI小鼠的繁育路线。
构建策略I
使用loxp-stop-loxp系统[2]进行条件性表达靶基因时（如下图），在未删除loxp片段之前，小鼠表达野生型基因，在删除loxp片段后，小鼠表达点突变后基因。
配繁原则是配cre工具鼠，删除stop元件，构建KI小鼠或者组织特异性KI小鼠。
构建策略II
使用loxpmut-cre系统[3]进行条件性表达靶基因时（如下图），
配繁原则是CKI小鼠配cre工具鼠，野生型的loxp之间的基因首先发生倒置，使得lox2272位点变为同向，同时发生片段删除，表达预期的靶位点，所以通过配繁不同的cre工具小鼠，可以获得不同组织表达的基因的定点突变。
繁育路线一
目标得到全身插入小鼠
1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代阳性鼠（F1代小鼠需测序）；选择需要的line繁育；
2.阳性F1代Fl/wt小鼠配全身性cre小鼠，得到KI/wt-creT小鼠（全身敲入目的基因且带有cre基因）；
3.KI/wt-creT小鼠配背景鼠，得到KI/wt-creW小鼠（全身敲入目的基因且不带有cre基因）；
4.KI/wt-creW小鼠互配得到KI/KI-creW小鼠。（全身敲入目的基因纯合小鼠）
繁育路线二
目标得到组织特异性插入小鼠
1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代阳性鼠（F1代小鼠需测序）；选择需要的line繁育；
2.阳性F1代Fl/wt小鼠配组织特异性cre小鼠，得到fI/wt-creT小鼠（组织特异性敲入目的基因且带有cre基因）；
3.fI/wt-creT小鼠配fI/wt-creW或fI/wt小鼠，得到fI/fl-creT小鼠。（组织特异性敲入目的基因纯合小鼠）
繁育路线三
目标得到flox小鼠
1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代阳性鼠（F1代小鼠需测序）；选择需要的line繁育；
2.阳性F1代Fl/wt小鼠互配，得到fI/fl小鼠。（组织特异性敲入flox纯合小鼠）
Cas9-CKI小鼠繁育还是比较专业的，但是理清了思路就明白其中奥秘了。对于需要配cre工具鼠的CKI小鼠来说，如果想要得到纯合插入的小鼠，使用的cre应避免与目的基因在同一染色体上，否则得不到纯合插入小鼠。万里阳光道，不负上心人，在小鼠繁育的道路上，你多上点心知道的多一点，就更能把握正确的方向。
漫漫科研路，莘莘同行人，加油~
参考文献
[1] Shalem O , Sanjana N E , Hartenian E , et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014, 343(6166):84-87.
[2] Sblattero D , Lou J , Marzari R , et al. In vivo recombination as a tool to generate molecular diversity in phage antibody libraries[J]. journal of biotechnology, 2001, 74(4):303-315.
[3] Yu G , Xin-Tai Z . A New Combination of Mutated loxPs in a Vector for Construction of Phage Antibody Libraries[J]. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica(7):7.
