蛋白纯化常见问题
1. 蛋白纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 测过基因序列，没有问题。有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？
细胞破碎后，融合蛋白表达在沉淀里，用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。 既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护蛋白，再做蛋白纯化就可以了，遇到这样的蛋白用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，那些表面活性剂能不用还是不用的好，失去活性可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。
2.有没有合成过配体为FMN的亲和胶？
现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此可以选择自己适合的活化介质。
不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。是不错的选择。
包涵体蛋白复性最管用的办法也是最简单的方法,在包涵体蛋白复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。
3. Sephadex G-25柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？
除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。
4. 蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换色谱和亲和蛋白纯化，用聚乙二醇修饰它，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100％，修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）？
用凝胶色谱纯化这是不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此蛋白可以选择sephadex G50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，可以试试，亲和能不能分开，这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。
5. 从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液提取），总是拿不到蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？
既然是提取那肯定是有沉淀和上清，目标蛋白的分子量是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题再解决如何提取。对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。
6. HPLC是用来分析检测or分离纯化？如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？
HPLC既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具. 分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。
7. 利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等）。
反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.
8. 有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，怎么设计纯化步骤？用离子交换柱，纯度可以达到60%，下边该怎么做？
至于纯化，如果蛋白有游离的巯基，很多时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B，可以问pHarmacia公司的人。如果没有，只好用离子交换，凝胶过滤，既然抗菌，知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，抗生素有的需要疏水结构，也可以用疏水试试。同时是包涵可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。
9. 用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda），用什么填料比较好？
对于小分子的配基需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候蛋白纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，选择这样的方法，偶联很简单
10. 一个蛋白药物的分子量大约是7000，等电点4，目前要内毒素去除有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）
用分子筛，superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH 1ml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。去除都是用内毒素去除亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到<10EU/mg
