显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速检测中
作者：张淑红，吴清平，张菊梅
作者单位：广东环凯微生物科技有限公司，广州510070；2．广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州510070
[摘要] 目的：研究显色培养基对单核细胞增生李斯特菌的检测效果，探讨建立新型快速检测方法。方法：检测按国标GB4789—33程序进行。结果：人工污染样品和实际样品检测中，显色培养基CHROMagar Listeria和HKListeria与传统平板OXA和MMA可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有更高的特异性。结论：用显色培养基检测单核细胞增生李斯特菌是一种新途径，可大大提高检测效率。
[关键词] 显色培养基；单核细胞增生李斯特菌；快速检测
单核细胞增生李斯特菌(简称“单增李斯特菌”)是一种重要的食源性致病菌，广泛存在于肉类、禽类、乳制品等食品中，引起新生儿脑膜炎和成人败血症等疾病，是食品微生物的常检项目之一。美国食品和药品管理局(FDA)、美国农业部(USDA)、ISO11092标准、国际分析委员会(AOAC)和中国国标(GB4789—33)等都建立了各自的检测方法，所用培养基包括OXA、PAL、MMA、MOX、TSA—YE等，但只适用于李斯特菌的选择性分离培养，不能特异性分离单增李斯特菌。目前仍需一种选择性平板可以有效的分离单增李斯特菌。鉴于此，一些显色培养基如CHROMagar Listeria(法国科玛嘉)、HKListefia(广东环凯)等不断开发出来，用于单增李斯特菌的快速检测中，直接根据菌落颜色和形态就可对菌种作出鉴定，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。本文通过对人工污染样品和实际样品检测，比较了CHROMagar Listeria、HKListeria与传统平板OXA、MMA的检测效果。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
单增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC94002、大肠杆菌Escherichia coli 8099、沙门菌Salmonella typhi、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、粪链球菌Enterococcus faecalis、英诺克李斯特菌L.innocua(简称“英诺克”)、威尔李斯特菌L.welshimeri(简称“威尔”)分离株由广东省微生物研究所微生物检测新技术发展中心提供。
1.2 培养基及试剂
HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA、TSA-YE、LB1、LB2李斯特菌增菌液、萘啶酮酸、丫啶黄、李斯特菌生化鉴定管等由广东环凯微生物科技有限公司提供。
1.3 主要仪器
法国生物梅里埃公司Biomerieux全自动微生物鉴定系统，API Listeria生化检测试剂条。
1.4 样品
试验所用样品猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、熟食、蔬菜、蛋糕等，均采集于附近超市和肉菜市场。
1.5 方法
1.5.1培养基制备 HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA按生产厂家的说明书制备，MMA、TSA-YE按国标GB4789-33法配制。
1.5.2显色培养基特异性检验 将单增李斯特菌、英诺克、威尔、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、粪链球菌在脑心浸液琼脂，大肠杆菌、沙门菌在营养琼脂培养基上培养24 h后，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA、MMA培养基，37℃培养24 h，观察。
1.5.3显色培养基灵敏度检验 (1)挑取1环单增李斯特菌加到10 ml 0.85％生理盐水中配成原液，然后进行10倍梯度稀释，取10-4、10-5、10-6 菌液各100ul ，分别涂布HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE平板。37℃培养36h，计数菌落数。(2)取单增李斯特菌10-3～10-8浓度菌液，分别加入2．1×104cfu／ml金黄色葡萄球菌、1.4×104 cfu／ml蜡样芽孢杆菌、1.6×104 cfu／ml大肠杆菌和1.3×105cfu／ml粪链球菌，震荡混匀，取100分别涂布HKListeria、CHROMagarListeia和OXA平板，以10-3～10-8 纯菌液涂布TSA-YE做对照，37℃培养36 h，计数单增李斯特菌菌落数，比较在干扰菌株浓度较高而目标菌较低时各培养基的灵敏度。
1.5.4人工污染样品
1.5.4.1 纯菌污染样品检测：将单增李斯特菌梯度稀释后，取10-3—10-8“菌液各1 ml，分别加入到10 g猪肉和9 ml牛奶中，均匀混合2 h。按国标GB47893—33方法增菌，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培养基，37℃培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。
1.5.4.2 单增李斯特菌和非李斯特菌混合污染样品检测：将单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门菌、粪链球菌近似等比例混合后，10倍梯度稀释成10-3～10-8 不同浓度的混合菌液，各取1 m1分别加入到10 g猪肉和9 ml牛奶中，按国标GB47893—33增菌后，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培养基，37℃培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。
1.5.4.3 单增李斯特菌、英诺克和非李斯特菌混合污染样品检测：由于样品中李斯特菌数量一般较少，约1—10 cfu／ml，而英诺克是单增李斯特菌的主要竞争菌，其他李斯特菌对单增李斯特菌影响不大，因此将单增李斯特菌和英诺克按100 cfu：10 cfu、10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu 3种近似比例混合，然后加入(104 -105)cfu／ml金黄色葡萄球菌、(104 -105 )cfu／ml蜡样芽孢杆菌、(104 -105)cfu／ml大肠杆菌、(104 -105 )cfu／ml沙门菌、(104 -105 )cfu／ml粪链球菌，制成混合菌液，分别加入到9 ml牛奶和10 g猪肉中，按国标GB47893—33法，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，37℃培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。
1.5.5实际样品从市场购买实际样品共62份，按国标GB4789—33增菌，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，观察李斯特菌的检出情况。
1.6 分离鉴定
将疑似菌落进行纯化，用法国生物梅里埃公司API Listeria试剂条，并结合传统生化鉴定方法进行鉴定。
2 结果
2.1 显色培养基的特异性
显色培养基特异性检验结果如表1。HKListeria、CHROMagar Listeia具有较好的特异性，单增李斯特菌呈现蓝色带白色晕环的菌落，威尔和英诺克李斯特菌呈现蓝色无晕环菌落；金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌在CHROMagar Listeia上略有生长，呈现绿色无晕环菌落，菌落形态与单增李斯特菌也有明显区别；在上述两种显色培养基上大肠杆菌和沙门菌等革兰阴性菌均被抑制。与显色培养基相比，OXA、MMA特异性较差，不能特异区分单增李斯特菌。
表1 不同菌株在各种培养基上的生长情况
单增李斯特菌 | 英诺克 | 威尔 | 金黄色葡萄球菌 | 蜡样芽孢杆菌 | 粪链球菌 | 大肠杆菌 | 沙门菌 | |
HKListeria | 蓝晕环 | 蓝 | 蓝 | - | - | - | - | - |
CHROMagar Listeria | 蓝晕环 | 蓝 | 蓝 | 绿 | 绿 | 蓝 | - | - |
OXA | 黑 | 黑 | 黑 | - | - | - | - | - |
MMA | 白 | 白 | 白 | 白 | 白 | 白 | - | - |
2．2 显色培养基灵敏度检测结果
单增李斯特菌10-4、10-5、10-6 纯菌液在各培养基上的生长情况如表2。对各培养基上的菌落数进行方差分析，P>0.05，表明HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE对单增李斯特菌的检出率无显著差异，其灵敏度相当；单增李斯特纯菌10-3-10-8 菌液混合金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和粪链球菌后，涂布平板的结果如表3。方差分析结果表明，P>0.05，4种培养基的灵敏度相当，当有高数量杂菌存在时同样可以达到相同的检测限。
表2 单增李斯特菌在各个培养基上的生长情况(Mean±Sd)
培养基 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
HKListeria | 多不可计 | 135±1.15 | 17±3.05 |
CHROMagar Listeria | 多不可计 | 135±1.15 | 19±0.58 |
OXA | 多不可计 | 137±1.85 | 20±1.15 |
TSA-YE | 多不可计 | 140±2.08 | 22±1.53 |
表3 非李斯特干扰菌存在下各培养基上单增李斯特菌数(Mean±Sd)
10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | |
HKListeria | 多不可计 | 多不可计 | 193±3.4 | 11±1.15 | - | - |
CHROMagar Listeria | 多不可计 | 多不可计 | 197±1.75 | 15±1.15 | - | - |
OXA | 多不可计 | 多不可计 | 202±3.00 | 9±1.67 | - | - |
TSA-YE | 多不可计 | 多不可计 | 209±3.00 | 17±1.00 | 1 | - |
TSA—YE上为单增李斯特菌纯菌液的涂布结果(对照)
2.3 人工污染样品检测结果
纯菌污染样品检测结果：用单增李斯特菌10-3-10-8浓度菌液污染牛奶和猪肉后，按国标检测结果表明，所有稀释度增菌后在4种培养基上都能检出，其中在HKListeria和CHROMagar Listeia上呈现蓝色带晕环菌落，在OXA和MMA上分别呈现黑色和蓝白色菌落，HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA可以达到相同的检测结果。
单增李斯特菌和非李斯特菌混合污染样品检测结果：将单增李斯特菌和非李斯特菌10-3～10-8 混合菌液污染牛奶和猪肉后，国标检测结果表明，这4种培养基上都可以检测出单增李斯特菌，说明非李斯特菌存在时，HKListeria、CHROMagarListeia、OXA、MMA仍可以达到相同的效果，非李斯特菌对单增李斯特菌没有太大影响。单增李斯特菌、英诺克和非李斯特菌混合污染样品检测结果：当单增李斯特菌和英诺克按100 cfu：10 cfu混合污染牛奶和猪肉后，按国标法4种培养基都可检出单增李斯特菌，在HKListeria和CHROMagar Listeia上呈现蓝色带晕环菌落，英诺克呈现蓝色无晕环菌落，其他杂菌基本不长，在OXA和MMA上单增李斯特菌和英诺克都分别呈现黑色和蓝白色菌落，二者无法区分；当单增李斯特菌和英诺克按10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu比例混合时，HKListeria和CHROMagar Listeia上只有英诺克生长，单增李斯特菌和其他非李斯特菌均未生长，表明英诺克存在时对单增李斯特菌检测有一定影响。
2.4 实际样品检测
实际样品检验结果如表4。62份实际样品共检出李斯特菌15份，其中猪肉检出英诺克4株，格式李斯特2株；鸡肉检出单增李斯特菌1株，英诺克3株，格式李斯特2株；鱼肉检出英诺克2株；牛肉检出英诺克1株；其他样本未检出。阳性样品在4种培养基上检测结果符合率为100％。HKListeria、CHROMagar Listeia的检测效果优于OXA、MMA，能够区分单增李斯特菌和其他李斯特菌。表4 实际样品中李斯特菌检测结果
样品 | HKListeria | CHROMagarListeria | OXA | MMA |
猪肉（19份） | 6（31.6%） | 6（31.6%） | 6（31.6%） | 6（31.6%） |
牛肉（5份） | 1（20%） | 1（20%） | 1（20%） | 1（20%） |
鸡肉（17份） | 6（35%） | 6（35%） | 6（35%） | 6（35%） |
鱼肉（10份） | 2（20%） | 2（20%） | 2（20%） | 2（20%） |
熟食（3份） | 0 | 0 | 0 | 0 |
蔬菜（4份） | 0 | 0 | 0 | 0 |
蛋糕（4份） | 0 | 0 | 0 | 0 |
括号中表示同一类样品中阳性样本的检出率
3 讨论
利用显色培养基鉴定细菌是一种新的快速检测方法，通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物，直接观察菌落颜色就可对菌种作出鉴定。在HKListeria和CHROMagarListeria显色培养基上，单增李斯特菌呈现蓝色带晕环的菌落，其他李斯特菌呈现蓝色不带晕环的菌落。金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、粪链球菌等杂菌或被抑制或没有晕环，菌落形态与单增李斯特菌有明显区别。
在本试验中，对单增李斯特纯菌液、单增李斯特和非李斯特菌混合菌液的检测结果表明，HKListeria、CHROMagar Listeria上单增李斯特菌的检出率与对照平板TSA—YE没有明显差异，说明HKListeria和CHROMagar Listeria对单增李斯特菌基本没有抑制作用；人工污染样品和实际样品检测结果表明，HKListeria和CHROMagar Listeia具有更高的检测效率，可根据菌落颜色和形态直接对单增李斯特菌作出鉴定，而OXA、MMA上生长的菌落还需进一步生化鉴定才能确定结果。因此，HKListeria和CHROMagar Listeria具有较高灵敏度、特异性和选择性，是非常有价值的分离平板，可为食品微生物的快速检测提供有力帮助。
另外，试验中还发现，当样品中英诺克数量高于单增李斯特菌时，单增李斯特菌不能够有效地检出。Restaino L等人也曾有类似的报道，英诺克数量高时容易造成单增李斯特菌检测结果的假阴性。分析可能是英诺克在增菌过程中生长过快，数量过多，对单增李斯特菌产生了一定的竞争或抑制作用。因此，在使用显色培养基检测单增李斯特菌时，要特别注意英诺克的干扰问题。
[参考文献]
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