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定点诱变实验——利用PCR引物点突变

2019.3.25
实验材料

DNA

试剂、试剂盒

DNA聚合酶klenow限制性内切酶

仪器、耗材

水浴锅离心机培养箱

实验步骤

1.  制备模板(见基本方案,步骤1和2)
 

2.  合成和纯化寡核苷酸引物并对5‘端磷酸化。

 

3.  扩增模板DNA(基本方案,步骤4和5),在最后一次延伸结束后,加5 U 的klenow酶,30℃保温15 min。


4.  分析并处理反应产物(基本方案1,步骤6和7)。

5.  取所得扩增片段的一半量用侧翼序列内的限制性内切酶切割,低熔点琼脂糖凝胶电泳 纯化酶切片段。

 

6.  将两个扩增的片段通过平末端连接亚克隆入合适的载体。

7.  按基本方案1,步骤10、11进行。

 

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