酵母的转化及突变体的透射电镜观察
实验概要
本实验制备了酵母感受态细胞，转化细胞在以葡萄糖为碳源的SD培养基中诱导后，对突变体进行了透射电镜观察。
主要试剂
SD培养基配方:
12 g/L NaOH；
20 g/L琥珀酸(Succinnic acid )；
事先将这两种药品溶解，再加下述药品；
1.7 g/L，无硫酸铵的酵母氮源(Yeast Nitrogen Base (YNB) )；
加入必需氨基酸至0.004%；
若需要，加入腺嘌呤、尿嘧啶至0.002%；
1g/L硫酸铵；
20 g/L碳源(葡萄糖或半乳糖)；
若配置固体培养基，加入20 g/L琼脂粉；
灭菌20-30 min。
实验步骤
1. 酵母感受态制备及转化
参照Clontech公司的酵母操作手册进行。
1) 挑取几个直径在2-3 mm的新鲜酵母克隆，接种到lml SD培养基中，剧烈震荡5min以使细胞团块分散均匀；
2) 转入50mI SD培养基中，30℃，250rpm过夜培养16-18h，使细胞生长状态达到稳定期(OD600> 1.5 )；
3) 用SD培养基稀释过夜培养物，使酵母细胞液OD600为0.2-0.3；
4) 30℃，250rpm继续培养3h左右，至OD600为0.4-0.6；
5) 将细胞转入50mI离心管中，室温，1000g，离心5min；
6) 弃上清，用无菌超纯水重悬起细胞沉淀，合并于同一个离心管中；
7) 室温下，1000g，离心5min，弃上清；
8) 用1.5ml新鲜制备的1 X TE/1 X LiAc重悬，即为酵母感受态细胞；
9) 将0.1 ug质粒DNA及0.1ug蛙精DNA加入1.5ml的Ep管中充分混匀；
10) 加入0.1 ml酵母感受态细胞，振摇混匀；
11) 加入0.6ml PEG/LiAc溶液(每lml PEGILiAc中含有：800ul150% PEG，100ulLiAc，100ul I0XTE)，反复吸打混匀；
12) 30℃，200rpm培养30min；
13) 加入70ulDMSO，轻轻颠倒混匀；
14) 42℃水浴热击15min；
15) 冰上放置1-2min；
16) 室温下，14000rpm离心5s，弃上清；
17) 用0.5mI无菌1 X TE重悬细胞；
18) 取100ul重悬细胞涂布于含有合适SD培养基的平板上，用灭菌玻璃珠均匀涂布；
19) 平板于30℃温箱中倒置培养约2-4天。
2. 酵母表型诱导
挑取4-5个单克隆接种于SD培养基(以半乳糖为碳源)中，过夜培养；1000g，离心5min，收集细胞沉淀，转入以葡萄糖为碳源的SD培养基中诱导细胞，30℃，250rpm培养l0h。
3. 透射电镜观察
1) 1000g，离心5min，收集细胞沉淀；
2) 将组织块放入2.5%戊二醛固定液中，4℃下固定24h；
3) 用0.1 M磷酸缓冲液冲洗3次，每次20min；
4) 1%饿酸中室温下固定2h；
5) 0.1M磷酸缓冲液冲洗3次，每次20min；
6) 50%-70%-80%-90%-100%-100%系列梯度丙酮脱水，每次20min；
7) 812树脂包埋；
8) 钻石刀、LKB- V型超薄切片机切片，TEM观察、照相。
