RIP测序解析RNA结合蛋白SORBS2在卵巢癌细胞转移中的作用...
RIP测序解析RNA结合蛋白SORBS2在卵巢癌细胞转移中的作用机制
作为环状RNA和RNA甲基化领域的领跑者，云序生物最近一个月捷报频传。RNA甲基化领域，云序m6ARNA甲基化测序服务协助上海交大余健秀组发表18年国内首篇10分以上RNA甲基化文章（“Nucleic Acid Research”，IF:10.162)；环状RNA领域，云序环状RNA测序服务助力多篇世界第一篇，包括：世界第一篇小鼠大脑创伤外泌体环状RNA研究，世界第一篇非洲爪蟾环状RNA研究，世界第一篇红斑狼疮性肾炎环状RNA研究(Cell子刊，IF:6.329)。
近日，又一个云序独家产品：RIP测序（RIP-Seq）助力华西医学院发表12分顶级期刊。四川大学周圣涛团队巧用RIP测序解析RNA结合蛋白SORBS2在卵巢癌细胞转移中的作用机制，为卵巢癌的靶向治疗提供了重要依据，课题思路新颖﹑非常具有借鉴性。
研究背景：
卵巢癌是一种致死率很高的妇科恶性肿瘤。由于介导该疾病发生发展的分子机制还未被清楚阐释，针对该疾病的治疗和诊断效果一直不理想。此外，基于RBP （RNA binding protein，RNA结合蛋白）的mRNA 转录后调控是否与卵巢癌以及免疫功能相关仍不确定。文章通过现有数据库（cBioPortal TCGA，AOCS等）明确SORBS2 (Sorbin and SH3 domain containing 2) 作为卵巢癌转移抑制的关键分子并且SORBS2的表达量与卵巢癌病人的预后相关，SORBS2敲减实验证明该分子主要影响卵巢癌细胞的转移而不会显著改变增殖信号通路。RIP测序（云序生物提供）联合全转录组测序的相关生物信息学分析提示SORBS2结合并稳定部分转录本，其中WFDC1和IL-17D作为SORBS2结合的重要靶点可以抑制卵巢癌细胞的转移灶的定殖。
研究思路：
作者通过对所有编码RBP的基因进行了两次基于数据库的筛选打分将与卵巢癌相关的关键分子锁定至SORBS2。 为了寻找SORBS2的潜在下游靶点，RIP-Seq 将SORBS2-RNA复合物免疫富集，对SORBS2结合的RNA进行测序，高通量分子测序结果给出了和SORBS2结合的所有RNA分子。此外，转录本稳定性实验（Transcript Stability Assays）对SORBS2敲减细胞系中所有的转录本半衰期进行计算从而得到所有因为SORBS2敲减稳定性下降的转录本。比较SORBS2结合的转录本（来自RIP-Seq）数据集和转录本稳定性数据集（全转录组稳定性分析），被SORBS2直接结合的转录本在SORBS2敲减后稳定性下降的转录本集合中有明显富集。该结果证明在卵巢癌当中，SORBS2可以通过与转录本直接结合从而使转录本更加稳定。SORBS2结合的转录本当中，91个（8.38%）作为卵巢癌转移SORBS2下游的潜在靶点。根据这些潜在靶点是否表达分泌蛋白进一步把范围缩小至7个基因，经过临床样本分析、回补实验和其他分子生物学实验以及动物实验验证，由SORBS2直接结合的WFDC1和IL-17D在SORBS2敲减后下降，并且这两个基因可以抑制卵巢癌细胞转移灶定殖。后续工作还明确了SORBS2识别并且稳定这些具有癌细胞转移抑制作用转录本的作用域ZnF_C2H2，SORBS2敲减介导的分泌蛋白质组改变和单核细胞（monocyte）到骨髓衍生抑制细胞（MDSCs）和M2样巨噬细胞极化相关。
研究一：从数据库中筛选确定SORBS2
基于RBP对于mRNA的转录后调控是否与卵巢癌细胞转移以及免疫功能相关还不清除，如何建立RBP和该疾病的联系是首先需要回答的问题。基于三个原则和已经发表的文献对1345个RBP编码蛋白进行打分，三个打分条件分别是1）肿瘤组织中的表达量低于正常组织；2）转移灶处表达量比原发处表达量低；3）与干细胞状态呈负相关。初筛将范围缩小至145 RBP基因。根据TCGA数库中这些基因的扩增（amplification）和删减（deletion）情况，确定其中四个BTF3、SORBS2、CIBRP和MEX3D最有可能与卵巢癌相关的基因。Transwell实验和siRNA实验证明SORBS2和MEX3D敲减可以增强卵巢癌细胞的转移灶定殖能力。结合AOCS数据库预测值，TCGA数据库的GSEA分析结果（TGF-beta和细胞黏附）均进一步证明SORBS2是抑制卵巢癌转移的关键RBP。临床样本信息库（CSIOVDB、West China cohort of ovarian cancer）同样证明SORBS2与卵巢癌病人的治疗效果相关，临床分级越高，癌细胞分化程度越高且病人预后越差时，SORBS2表达下调越明显。同时分子实验证明，在卵巢癌细胞系中沉默SORBS2在体内体外均增强卵巢癌细胞的转移，但不影响这些细胞的增值和生长速率。
研究二：高通量测序结果锁定WFDC1和IL-17D
既然SORBS2的细胞表型与功能都已确定，那么这一重要的RBP如何在卵巢癌细胞中发挥作用？哪些SORBS2靶标最关键？云序生物RIP测序结果给出所有SORBS2直接结合的靶点，联合全转录组范围RNA稳定性实验以及全转录组测序结果证明SORBS2可以与部分转录本结合并使他们更加稳定，其中91个基因被锁定。功能分析（GO分析和KEGG通路分析）表明这些基因发挥着丝粒组装等生物学功能并富集于FoxO等信号通路。这91个基因中仅7个基因可以编码分泌蛋白，其中WFDC1和IL-17D在SORBS2敲减后稳定性降低。分子实验证明无论过表达或者沉默SORBS2，WFDC1和IL-17D稳定性相对应的增强或减弱。SOSRBS2调节两者稳定性的方式是结合3’UTR区域而不改变3’UTR的长度。明确SORBS2与WFDC1和IL-17D的联系之后，这种结合并稳定的关系在卵巢癌细胞中发挥怎样的生物学功能？临床信息显示，SORBS2表达量低的病人样本中WFDC1和IL-17D的表达量也相对较低。无论动物实验（测转移结节）还是细胞实验（Transwell侵袭模型），回补过表达WFDC1或者IL-17D都能抑制卵巢癌细胞的转移能力或侵袭能力。
研究三：结合功能域和免疫调节
SORBS2主要含有三种结构域，SoHo、ZnF_C2H2以及SH3, 三个突变实验分别对应突变一个结构域。卵巢癌细胞转染实验以及动物实验发现ZnF_C2H2是SORBS2结合并稳定转录本时所必须的功能结构域。既然WFDC1和IL-17D都是SORBS2低表达癌症细胞的分泌因子，那么它们是否对卵巢癌细胞转移的肿瘤微环境有影响？实验证明SORBS2敲减介导分泌蛋白改变与单核细胞、MDSC和M2型巨噬细胞极化相关，SORBS2在肿瘤微环境中有稳定转录本和免疫调节作用。源于癌症的SORBS2稳定的分泌蛋白体可以有效地抑制卵巢癌转移并调节体内肿瘤促进性骨髓细胞的积聚。
结语：
文章揭示了RNA结合蛋白SORBS2在卵巢癌肿瘤细胞转移过程中的重要生物学作用，从数据库搜索到通过RIP-seq锁定SORBS2靶基因，相关结果提出了一个全新的连接癌症发展和免疫调节的转录后调控网络，这一网络依赖于SORBS2结合并稳定转录本的重要生物学作用。
原文：
The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript Genome Biol, 2018, DOI: 10.1186/s13059-018-1412-6.
作者简介：
周圣涛教授，四川大学华西第二医院党委委员、妇产科副主任医师。团队主要围绕卵巢癌等妇科恶性肿瘤发生发展分子机制领域开展系统研究，在蛋白质组学及RNA领域和肿瘤微环境调控癌细胞可塑性与肿瘤转移领域取得了系统性的创新成果，其中包括在Genome Biology、PNAS、Cancer Research、Oncogene、Mass Spectrometry Reviews、Molecular & Cellular Proteomics等国际著名杂志发表的论文。
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技术原理
