Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）-2
）标记探针检测
取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。
如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA稀释液按
10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。
五、基因组DNA 酶切
限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶的特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃
1小时内能将1μg
DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
通常，10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
在正式酶切之前先用20μl小体系预酶切看是否切得动，然后用大体系37℃酶切过夜。
1、酶切体系：
| 组份 | 加量 |
| 10×buffer | 4.5μl |
| HindШ 内切酶 | 6.5μl |
| 样品DNA | 25μg |
| ddH2O | 补足水至45μl，于37℃水浴中酶切20h |
每一种酶都有其相应的最佳缓冲液，以保证最佳酶活性，使用时的缓冲液浓度应为1×。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响
酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上检测酶切是否充分。如果酶切充分，灌制1%的agrose胶，加入上样buffer后，在25-30V稳压电泳 12-24hrs（包括DNA Marker）。
2、电泳
1%浓度琼脂糖凝胶、TBE buffer（EB 染料电泳后染）
100ml TBE buffer中加入10μl 10mg/ml溴化乙锭（EB）,将凝胶放置其中染色30分钟, 照相。
六、转膜
1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）
2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）
3、用蒸馏水冲洗2 次。加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。
4、用蒸馏水冲洗2 次。加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl ， pH7.4）室温振荡2×15min；
5、用蒸馏水冲洗2 次。加入2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜 5min；
6、虹吸印记法转膜26 小时
1) 在方盘上放置一平板，其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入2×SSC中，用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。
2) 将凝胶倒置于平台上, 正面朝下，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。
3) 将尼龙膜放于胶上，赶走气泡。
4) 膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。
5) 吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向尼龙膜的上行通路，以洗脱凝胶中的DNA 并使其聚集到尼龙膜上。
6) 室温下过夜转膜，持续16小时以上，期间换纸2-3次。
7）完成转膜后，胶染色，观察转膜效果。并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标准的位置，尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。
8）用2×SSC漂洗尼龙膜一次，滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定DNA(5000μJ /cm2)5min。
七、杂交
1）预杂交：取8.0ml 65℃预热的Hyb
高效杂交液（Hyb-100），加入杂交管中，排尽气泡，65℃杂交炉中预杂交2h（8-15转/分）。（此步中高效杂交液的用量根据
9.8cm×8.0cm计算所得，1ml高效杂交液/10cm2胶，9.8×8.0=78.4 ）
2）探针变性：将已标记好的探针沸水浴中变性10 分钟，立即放冰水浴冷却10min(探针一经变性，立即使用)。
