Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）-3
3）杂交：排尽预杂交液，在8.0ml 新Hyb 高效杂交液（Hyb-100）加入4.0μl 新变性好的探针(1-3ul/膜，5-20ng/ml杂交液)，混匀。65℃杂交仪中杂交过夜（8-15转/分）。
4）杂交完成后，将杂交液回收置于一可耐低温又可耐沸水浴的管中，贮存于-70℃以备重复使用。重复使用时，解冻并在65℃下变性10min.。
八、洗膜、信号检测（(化学显色法)
1）杂交后室温下，20 ml 2×SSC/0.1%SDS 洗膜2×5min。
2）50℃，20 ml 0.1×SSC/0.1%SDS 洗涤2×15min。（洗液需要先预热到50℃）
3）再将膜置于20ml 洗涤缓冲液中平衡2-5min。
4）将膜在10 ml 阻断液中阻断30min（在摇床上轻轻摇动）。
5）封闭完成后倒出阻断液，加入稀释好的10ml 抗体溶液，浸膜至少30min。(Anti-Dig-AP 在10000rpm
离心5min。离心后将Anti-Dig-AP 用阻断液稀释(1:5000)，2.0μl Anti-Dig-AP 加入10ml 封闭液混匀)
6）去除抗体溶液，用20 ml 洗涤缓冲液缓慢洗膜2 次，每次15min。
7）去除洗涤缓冲液，在20 ml 检测液中平衡膜2 次，每次2min。
8）用检测缓冲液稀释300μl NBT/BCIP 化学显色底物，在约15ml 新鲜制备的显色液中反应显色，在显色过程中勿摇动。
注意：在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在16h后完成反应。为检测显色程度，膜可以短时碱暴露于光线下。
9）当达到所需的点或带强度后，用50ml双蒸水或TE 缓冲液洗涤5 min 终止反应，照相记录结果。
若是杂交结果不满意，尼龙膜可经过处理进行重杂交。膜重杂交前的处理如下：
a. NBT/BCIP化学显色法
1. 烧杯中盛装适量的DMF(Dimethylformamid,二甲基甲酰胺)，通风橱内50-60℃水浴。
注：DMF是挥发性的，且大约67℃时能够燃烧。
2. 将膜置于烧杯内，温育至褪色。
3. 用双蒸水彻底淋洗膜。
4. 用20-30ml 0.2N NaOH，0.1%SDS(w/v)37℃震荡洗涤2×20min。
5. 2×SSC平衡数分钟。
6. 空气干燥或立即用于杂交。
b. CDP-Star化学发光法
膜的存放
a. 若欲再杂交
在塑料袋中密封保存，任何时候膜都不能干。注：欲保持颜色，可用TE缓冲液保存。
b. 不再杂交
15-25℃干膜，存放。注：干膜过程中颜色会减淡，为再生颜色，可在TE缓冲液中湿润。
Southern溶液的配制
1、洗液Ⅰ的配制：250ml (2×SSC，0.1%SDS)
20×SSC 25ml 10%SDS 2.5ml ddH2O 至250ml
2、洗液Ⅱ的配制：100ml (0.1×SSC，0.1%SDS)
20×SSC 0.5ml 10%SDS 1ml ddH2O 至100ml
3、洗涤液：250ml (马来酸缓冲液：Tween-20=1：0.3%)
马来酸缓冲液 250ml Tween-20 750ul
4、马来酸缓冲液：(1×) 1L
马来酸 11.607g NaOH 7.88g NaCl 8.77g
定容至1L，用固体调至PH7.5，高压灭菌。
5、阻断液(10×) 500ml
Blocking Solution 50g 马来酸缓冲液 定容至500ml
70℃水浴溶化混匀，然后121℃高压灭菌(高压时盖子要松)
6、20×SSC 1L
在800ml水中溶解，NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g
10mol/L NaOH调节pH值至7.0.加水定容至1L，分装后高压灭菌
7、10%SDS 1L
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓HCl调节pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
注意：SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平的SDS，10%SDS溶液无须灭菌，过滤。
8、TE pH 8.0 1L
10mmol/L Tris•HCl(pH 8.0) 1 mmol/LEDTA(pH 8.0)
9、检测缓冲液(5×) 1L
0.5mTris•HCl 60.57g 0.5m NaCl 29.25g 调pH值至9.5
10、PBS缓冲液
NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g
浓HCl调pH至7.4
11、变性缓冲液 1L
1.5M NaCl 87.66g 0.5M NaOH 20g
12、0.25M HCl(脱嘌呤液) 250ml
2.5M HCl 25ml ddH2O至250ml
13、2.5M HCl 100ml
浓HCl 21.55ml ddH2O至100ml
14、中和缓冲液 1L
1.5M NaCl 87.66g 1MTris•HCl 121.14gTris,HCl调pH7.4 加水至1L。
1. 用双蒸水彻底淋洗膜。
2. 用20-30ml 0.2N NaOH，0.1%SDS(w/v)37℃震荡洗涤2×20min。
3. 2×SSC平衡数分钟。
4. 空气干燥或立即用于杂交
