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SARS-CoV-2蛋白互作网络图为老药新用提供新思路（二）

2021.3.01

靶向SARS-CoV-2人源宿主因子的现有药物

借助化学信息学工具，研究者们找到了靶向SARS-CoV-2人源宿主因子的16个批准药物，3个在研药物（临床实验阶段），以及18个临床前候选药物；另外，通过基于靶点和信号通路的文献搜索，他们还发现了13个批准药物，9个临床实验阶段的在研药物（INDs），和10个临床前候选药物。在所有332个高置信度人蛋白靶点中，有63个拥有已知靶向分子，总计69种批准药物/INDs/临床前化合物。

宿主靶向药物的病毒抑制能力

接下来，研究者们对这些药物的抗病毒活性进行了分析。这项工作由来自纽约的西奈山医院和巴黎的巴斯德研究所的两个团队分别完成。西奈山医院团队开发了一种中等通量的基于Celigo免疫荧光成像的方法（检测病毒核蛋白NP），在非洲绿猴肾细胞系Vero E6中对37种化合物进行了SAR-CoV-2感染抑制筛选。巴斯德所团队则通过qRT-PCR检测细胞上清病毒RNA的方法分析了44种药物的病毒抑制能力（Fig. 3a）。两个团队一共对69个药物中的47个进行了检测，另外还有13个靶向SaigmaR1/R2受体和mRNA转译的化合物，以及额外的15个其他方法筛选出的小分子。

病毒抑制实验方法（西奈山医院）

将Vero E6细胞以2000细胞/孔接种于96孔板（由于Vero E6是肾细胞系，因此不排除药物在肺细胞中会产生不同的结果）。病毒感染前2小时，将培养基替换为含有待测药物/化合物的培养基，对照孔加入相应浓度的DMSO。将培养板转移至P3安全等级实验室，加入100 PFU (MOI 0.025)的SARS-CoV-2，于37C培养48小时。感染完成后，去掉上清，向板中加入4%多聚甲醛固定细胞。24小时后，将培养板移出P3实验室。接下来，对细胞中的病毒核蛋白（NP）进行免疫荧光染色（SARS-CoV 抗血清，1：10000），并用DAPI染细胞核。Celigo成像细胞分析仪（Nexcelom Bioscience）被用于对感染的细胞（AF488）和总细胞（DAPI）进行荧光成像和定量分析。细胞中绿色荧光（NP）的强度反映了病毒感染的程度。感染率百分比可以通过((感染细胞数/细胞总数) – 背景) x 100%计算出。DMSO对照组的感染率被设置为100%以完成归一化。IC50和IC90值通过将Celigo的数据导出至GraphPad分析得出。

对于挑选出的药物，研究者们用被感染细胞的上清进行了病毒滴度检测并计算出TCID50。具体步骤为：SARS-CoV-2感染48小时后收集细胞上清，冻存于-80 ˚C直至使用。将Vero E6细胞以20000细胞/孔接种于96孔板。第二天，加入10倍梯度稀释（10^1 到10^6）的含SARS-CoV-2上清的培养基。五天后，将细胞用结晶紫染色，观察细胞病变（CPE）。用Reed&Muench方法计算TCID50/mL。