SARS-CoV-2蛋白互作网络图为老药新用提供新思路（三）
病毒滴度检测（巴斯德所）
病毒的滴度是通过蚀斑实验来检测的。将Vero
E6细胞以7.5x10^4/孔的密度接种于24孔板。第二天，加入10倍稀释的含病毒培养基，于37˚C孵育1小时。随后，加入0.005%琼脂糖形成半固体覆盖层。于37˚C孵育3天后用4%多聚甲醛固定和结晶紫染色，肉眼观察和计数每孔蚀斑数量（plaque
assay）。
西奈山医院团队用于检测药物抑制病毒能力的仪器为Celigo高通量成像细胞分析仪。该仪器配备有1个明场和4个荧光通道，能对生长在微孔板中的细胞进行高速全孔高清成像（检测一块96孔板的病毒抑制实验
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15分钟），并用内置软件识别每一个细胞，完成多重参数（包括细胞数量、大小、平滑度、平均荧光强度、总荧光强度、不同类型细胞百分比等）的定量分析。
病毒抑制/抗体中和的常用实验方法有很多种，包括如蚀斑减少中和实验（PRNT），病毒灶减少中和实验（FRNT）和基于ELISA的微中和实验等。与这些方法相比，基于自动荧光成像的方法节省人力和时间，减少了人为误差，通量高，灵敏度高，动态范围广，所需病毒量少（MOI低），非常适合抗病毒药物的高通量筛选。
值得注意的是法国巴斯德所团队采用的方法更为传统。qRT-PCR具有很高的灵敏度，因此也更容易产生交叉污染，对实验者的操作有很高的要求。另外，qRT-PCR反映的是RNA总量，不能直接体现病毒的感染复制能力。
用于病毒滴度检测的蚀斑实验通常只能肉眼人工计数，速度慢，通量低，且无法避免人为误差。Celigo可以对蚀斑实验的孔板进行全孔成像，软件自动识别蚀斑，得到每孔蚀斑数量、大小、平滑度等多个参数。Celigo也能检测HRP或荧光染色的病毒灶斑，甚至分析单个细胞水平的病毒感染率。
细胞毒性实验
西奈山医院团队用MTT方法对有和没有感染SARS-CoV-2的Vero E6细胞进行了药物浓度梯度的毒性实验。巴斯德所团队用阿尔玛蓝试剂检测药物对细胞存活率的影响。细胞存活率百分比通过基于健康细胞（100%）和乙醇处理的细胞（0%）做出的标准曲线计算得出。
药物安全性评估是药物筛选中非常重要的一个环节。常用的检测细胞毒性的方法大多基于细胞的酶活性和能量代谢，比如本文作者使用的MTT和阿尔玛蓝，还有CCK-8,
CellTiterGlo等。然而越来越多的研究显示这类方法得出的药物对细胞活性的影响与实际有偏差，尤其是能直接影响细胞酶活性和能量代谢的药物。
基于荧光染色的细胞计数是目前公认最准确的细胞活性检测方法。不同荧光染料的组合包括AO/PI, Calcein AM/PI,
PI/Hoechst等。对于西奈山团队的实验设置，在病毒感染和药物处理过程中加入PI，免疫荧光和DAPI染色后即可在同一块板上检测药物毒性。Celigo可以快速准确地得出整板细胞数和存活率，非常适合于高通量药物细胞毒性评估。
mRNA转译和Sigma受体抑制剂的SARS-CoV-2抑制作用
两个团队的实验结果显示有两类化合物可以抑制病毒感染：mRNA转译抑制剂（zotatifin, ternatin-4和PS3061; Fig.
3b, Extended Data Fig. 9）和Sigma1与2受体的抑制剂（包括haloperidol, PB28,
PD-144418和正处于临床实验阶段的羟氯喹）。其他的Sigma1和Sigma2受体抑制剂clemastine,
cloperastine和孕酮（Fig 3c, Extended Data Fig. 9）也具有病毒抑制能力。Fig.
3d展示的是用TCID50方法做出的部分药物病毒抑制曲线。值得注意的是，该结果显示PB28（IC90 = 280
nM）比羟氯喹的效力强~20倍。
西奈山团队也用Celigo荧光成像法检测了病毒感染前后不同时间加药对病毒感染（荧光强度）的影响。该实验用较高滴度（MOI=2）的病毒对细胞进行单轮感染（8小时）。结果显示羟氯喹、PB28和zotatifin不论在感染前还是感染后加入，对病毒感染的抑制能力是相似的（Fig.
3e），说明这些药物是在病毒复制的过程中发挥作用的。
研究者们相信，靶向Sigma1和2受体的小分子以不同于转译抑制的路径抑制病毒感染，比如通过调控细胞应激反应。值得关注的是，一些靶向Sigma受体的化合物，比如clemastine,
cloperastine和孕酮，都是经FDA批准上市多年的药物。另外，Sigma受体靶向化合物在有明显病毒抑制能力的同时具有较小的细胞毒性（Fig.
3b和c）。
Sigma1和2受体属于胞内侣伴蛋白，在中枢神经系统高度表达。相对于Sigma1受体，人们对Sigma2受体的了解较少。Sigma1受体可以调控电压依赖的离子通道，因而影响神经元的激活和突触活动，在突触可塑性，学习和记忆中都起到重要作用。此外，有证据表明Sigma-1受体和帕金森以及重度抑郁症有关联，因此成为这类疾病的热门靶点。
讨论与总结
本次研究获得的化学-蛋白质组学分析结果不仅提供了以SARS-CoV-2的人互作蛋白为靶点的潜在化合物信息，也揭示了这些化合物可能的作用机制。mRNA转译抑制剂显示出较强的病毒抑制作用（有效浓度在10
– 100
nM之间），使得这类化合物成为极具吸引力的潜在药物。虽然靶向Sigma1和2受体化合物的作用机制还不清楚，但是它们对病毒感染的控制能力值得关注。PB28的高效力（280
nM
IC90）和高特异性使其拥有很高的成药潜力。还有许多已批准的Sigma靶向药物拥有老药新用的潜能，值得评估其对SARS-CoV-2的抑制能力。
作为抗病毒疗法，宿主靶向的干预方式可以避免因病毒变异而产生的药物抗性，也为开发广谱抗病毒疗法从而应对未来其他病毒的爆发提供了可能性。另外，宿主靶向药物可以和病毒靶向药物（比如瑞德西韦）组成联合疗法，以达到更好的病毒抑制效果。更重要的是，本次研究所展示的工作流程代表了药物发现（不局限于广谱抗病毒疗法，也适用于其他疾病疗法的开发）的一种新方法，也是国际间多学科合作促进科学发展的一次完美体现。
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