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新一代CRISPR技术实现SARS-CoV-2高灵敏度即时检测

2021.6.29

新冠病毒检测对于控制疾病传播、及早诊断治疗具有重要意义。荧光定量PCR由于高灵敏度和特异性成为了新冠病毒检测的金标准。由于设备昂贵、操作繁琐，荧光定量PCR技术很难用于现场即时检测。近些年来，也开发出了重组酶扩增（RPA）、环介导等温扩增（LAMP）、DNA纳米传感器等快速检测方法。然而假阳性问题制约着这些技术的推广应用。“基因魔剪”CRISPR技术为这一问题的解决提供了新的思路。其中，CRISPR-Cas12和Cas13除了能够靶向切割目标片段，激活的Cas蛋白能够产生侧向切割活性，也就是非特异性切割其他片段，这一特性是CRISPR技术用于核酸检测的基础。加州大学Jennifer Doudna团队和麻省理工学院张锋团队分别开发了基于CRISPR-13的DETECTOR、基于CRISPR-12a的SHERLOCK检测系统。疫情期间许多研究者也开发了针对SARS-CoV-2的CRISPR检测产品。最近的两项研究在现有的CRISPR技术上进一步优化升级，提高了灵敏度和检测速度。（具体内容可参看：新技术助力冠状病毒快速检测）

标题

第一项研究是由麻省理工学院张锋团队主导的，题为“Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing ”发表在国际知名医学期刊NEJM上。研究者采用逆转录、LAMP、CRISPR技术偶联的策略，并优化了核酸提取步骤，代之以简单的磁珠富集方法，实现了一步法CRISPR核酸检测（STOPCovid.v2）。研究者通过对COVID-19临床样本进行双盲试验，结果显示新技术灵敏度93.1%、特异性98.5%，检测效力与荧光定量PCR一致。SARS-CoV-2阳性样本在15-45min内即可检出。该方法操作简单快速，灵敏准确，便于流水线批量操作，可以直接用试纸或荧光仪观察结果，成本、设备要求低。

检测流程与效果评价

第二项研究则是来自康涅狄格大学的刘长春团队，研究成果发表在国际知名期刊Nature Communications上，题为“Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay ”。研究者开发了多合一的AIOD-CRISPR检测平台。首先设计一对crRNA分别靶向两个靠近引物的不同位点，与cas12a形成复合物，同时在反应体系中加入DNA复制相关酶系。当RPA反应开始时，DNA双链解开并暴露出cas复合体结合位点，CRISPR-Cas识别并切割靶序列，同时活化切割报告元件，随着RPA反应进行，靶序列数量增多，活化CRISPR-Cas也增多，释放荧光数量指数级增加。研究者发现在LED、UV光甚至照明灯下也能明显观察到颜色差异，而且反应在37℃左右就可进行，在低温环境只需暖手宝就可启动反应。研究者分别对实验室病毒载体、临床样本进行测试，仅需20min就可肉眼分辨阳性样本，精确度与荧光定量PCR一致。该方法方便简单，可以直接观察，与相应的仪器配合使用，可以定量测定样本中病毒含量，同时成本低廉，仅需6美元。