离子交换柱层析分离核苷酸实验
离子交换层析法
| 实验方法原理 |
本实验以酵母RNA 为材料, 将RNA 用碱水解成单核苷酸,再用离子交换柱层析进行分离, 最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量, 可以计算出酵母RNA 的碱基组成。 |
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| 实验材料 | 酵母RNA |
| 试剂、试剂盒 | 阴离子交换树脂 聚苯乙烯-二乙烯苯-三甲胺季铵 甲酸 甲酸钠 KOH 蒸馏水 过氯酸 NaOH HCl AgNO3 |
| 仪器、耗材 | 层析柱 梯度洗脱器 电磁搅拌器 恒流泵 自动部分收集器 酸度计 紫外分光光度计 旋涡混合器 核酸蛋白检测仪 台式离心机 |
| 实验步骤 |
1. RNA 的碱水解 称取20 mg 酵母RNA, 置于刻度离心试管中, 加2ml 新配制的0.3 mol/ L KOH, 用细玻璃棒搅拌溶解, 于37 ℃ 水浴中保温水解20 h。然后用2 mol/ L HClO4 ( 过氯酸) 调水解液pH 至2以下( 要少量多次, 只需几滴即可) 。由于核苷酸在过酸的条件下易脱嘌呤, 所以滴加HClO4 时需用旋涡混合器迅速搅拌, 防止局部过酸, 再以4000 r/ min 的转速离心15 min , 置冰浴中10 min , 以沉淀完全。将上清液倒入另一刻度试管中, 用2 mol/L NaOH 逐滴将上清液pH 值调至8～9 , 作上样样品液备用。样品液上柱前, 取0.1 ml 稀释500 倍, 测定其在260 nm 波长处的光吸收值, 用以最后计算离子交换柱层析的回收率。 取201x8 粉末型强碱型阴离子交换树脂8 克(湿) , 先用蒸馏水浸泡2 h , 浮选除去细小颗粒, 同时用减压法除去树脂中存留的气泡, 然后用四倍树脂量的0.5 mol/ L NaOH 溶液浸泡1 h ,除去树脂中的碱溶性杂质。用去离子水洗至近中性后, 再用四倍量1 mol/ L HCl 浸泡半小时, 以除去树脂中酸溶性杂质。接着用蒸馏水洗至中性( 可以上柱洗) , 此时阴离子交换树脂为氯型。 离子交换层析柱可使用内径约1 cm、长10 cm 的层析柱, 柱下端有烧结上的垂熔滤板, 柱上端使用橡皮塞, 塞子中间打一小孔。紧紧插入一根细聚乙烯管, 层析柱夹在铁架台上, 调成垂直, 柱下端细胶管用螺旋夹夹紧, 向柱内加入蒸馏水至2/3 柱高, 再用滴管将经过预处理的离子交换树脂加入柱内, 使树脂自由沉降至柱底, 放松螺旋夹, 使蒸馏水缓慢流出, 再继续加入树脂, 使树脂最后沉降的高度约为6～7 cm。注意在装柱和以后使用层析柱的过程中, 切勿干柱, 树脂不能分层, 树脂面以上要保持一定高度的液面(不能太高, 约1 cm) , 以防气泡进入树脂内部, 影响分离效果。
树脂的转型处理就是使树脂带上洗脱时所需要的离子。本实验需要将阴离子交换树脂由氯型转变为甲酸型。先用200 ml 1 mol/ L 甲酸钠洗柱, 用1% AgNO3 检查柱流出液, 直至不出现白色AgCl 沉淀为止。然后改用约200 ml 0.2 mol/ L 甲酸继续洗柱, 测定流出液的A260≤0.020 为止。最后用蒸馏水洗柱, 直至流出液的pH 值接近中性(或与蒸馏水的pH 相同) 。
加样就是将RNA 碱水解产物转移到离子交换层析柱内, 使其被离子交换树脂吸附。先将柱内液体用滴管轻轻吸去, 使液面下降到刚接近树脂表面。旋紧下端螺旋夹, 用滴管准确移取1.0 ml RNA 碱水解样品液, 沿柱壁小心加到树脂表面, 然后松开下端螺旋夹, 使样品液面下降至树脂表面, 接着用滴管加入少量蒸馏水, 当水面降至树脂表面时, 再用约200 ml 蒸馏水洗柱, 将不被阴离子交换树脂吸附的嘌呤及嘧啶碱基、核苷等杂质洗下来。检查流出液在260 nm 波长处的吸光度, 直至低于0.020 为止。关恒流泵, 旋紧柱下端螺旋夹。
在梯度洗脱器的混合瓶内加入300 ml 蒸馏水, 贮液瓶中加入300 ml 0.20 mol/ L 甲酸-0.20 mol/ L 甲酸钠混合液(注意: 梯度洗脱器底部的连通管要事先充满蒸馏水, 赶尽气泡)。洗脱器出口与恒流泵入口用细塑料管相连, 打开两瓶之间的连通阀和出口阀, 打开电磁搅拌器, 松开柱下端螺旋夹, 开启恒流泵, 控制流速为5 ml / 管/ 10 分, 开启部分收集器, 分管收集流出液。以蒸馏水为对照, 测定各管在260 nm 波长下的A260 值, 给各管编号, 并标出最高峰的收集管。
分别测定最高峰管内液体在230～300 nm 之间, 每相差5 nm间隔的光吸收值。其中包括有250 nm、260 nm、280 nm, 290 nm各点( 注意: 液体均要保留, 切勿倒掉。测量时用石英杯)。由于在小于250 nm 时, 甲酸( HCOOH ) 具有很强的光吸收值,因此测定时所用参比对照液近似为:第一个峰用0.05 mol/ L 甲酸-0.05 mol/ L 甲酸钠。第二个峰用0.10 mol/ L 甲酸-0.10 mol/ L 甲酸钠。第三个峰用0.15 mol/ L 甲酸-0.15 mol/ L 甲酸钠。第四、五两峰用0.20 mol/ L 甲酸或0.20 mol/ L 甲酸钠。也可以根据最高峰所在位置, 计算甲酸、甲酸钠的浓度选择参比液。
分别合并(包括最高峰管在内) 各组分洗脱峰管内的洗脱液, 用量筒测出溶液总体积, 然后测定其A260 值, 参比对照液同上。根据层析柱上样液的A260 值以及层析后所得到的各组分A260值之和, 可以计算出离子交换柱层析的回收率( 注: RNA 的摩尔消光系数E260 为7.7x103 ～7.8x103 , 水解后增值40%) 。
使用过的离子交换树脂经过再生处理后, 可重复使用。可以在柱内处理, 也可以将树脂取出后处理。取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱内吹气, 用烧杯收集流出的树脂。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方法相同。也可以直接用1 mol/ L NaCl 溶液浸泡或洗涤, 最后用蒸馏水洗至流出液的pH值接近中性。
1. 作出阴离子交换树脂柱层析分离核苷酸的洗脱曲线, 以层析流出液管数(或体积) 为横坐标, 以相应的A260 值为纵坐标, 作出洗脱曲线图。
2. 作出各单核苷酸的紫外吸收光谱图, 根据各组分溶液在230～300 nm 波长范围内的吸光值, 以波长( nm) 为横坐标, 吸光值为纵坐标, 作出它们的吸收光谱图。由图上求出每个单核苷酸组分的最大吸收峰的波长值, 同时, 计算出各个组分在不同波长的吸光值比值( 250/ 260 , 280/ 260 , 290/ 260) , 将它们与各核苷酸的标准值列表比较, 从而鉴定出各组分为何种核苷酸。
3. 根据层析上样液的A260 值, 以及层析后所得到的各组分A260 值之和, 计算出离子交换柱层析的回收率。
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