蛋白质羰基含量检测试剂盒使用说明
产品内容:
提取液：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
紫外分光光度法
试剂一：粉剂 0.1g×3 支，4℃保存。（使用前根据样品数，每支加 1mL 水溶解，每支为 10 个样品用量）
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。（自备） 试剂六：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
产品说明：
蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。
羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿、蒸馏水， 无水乙醇和乙酸乙酯。
操作步骤：
一、样品处理
组织样品：称取约 0.1g 组织样品，加入 1mL 提取液，充分匀浆后于 4℃，5000rpm 离心 10min， 取上清，加入 0.1mL 试剂一，室温放置 10min，4℃，12000rpm 离心 10min，取上清，然后取 20μL 测定蛋白含量，剩余的作为待测样品。
二、测定步骤和操作表
空白管 | 测定管 | |
样品（mL） | 0.2 | 0.2 |
试剂二（mL） | 0.4 | |
试剂三（mL） | 0.4 | |
混匀，37℃避光反应 1h | ||
试剂四（mL） | 0.5 | 0.5 |
静置 5min，4℃，12000rpm 离心 15min，弃上清，留沉淀 | ||
试剂五（mL） | 1.0 | 1.0 |
漩涡混匀，4℃，12000rpm 离心 10min，弃上清，留沉淀。重复 3 次 | ||
试剂六（mL） | 1.0 | 1.0 |
漩涡混匀，37℃温育 15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000rpm 离心 15min，取 上清 1mL 于石英比色皿，试剂六调零，测定 OD370 |
三、计算公式
1、按蛋白浓度计算：
蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）=（OD370 测定管－OD370 空白管）÷（ε×d）×V÷(Cpr×V 样品)
=（OD370 测定管－OD370 空白管）÷4.4÷Cpr；
2、按样本鲜重计算：
蛋白质羰基含量（μmol/g 鲜重）=（OD370 测定管－OD370 空白管）÷（ε×d）×V÷(W×V 样品÷V 提取)
=（OD370 测定管－OD370 空白管）÷4÷W
ε：蛋白质羰基消光系数，22 mL•μmol-1•cm-1；d：比色皿光径，1cm；V：加入试剂六体积，1mL；
V 样品：加入样本体积，0.2 mL； V 提取：加入提取液及试剂一体积，1.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。W：样品质量，g。
注意事项：
1. 试剂一使用之前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。
2. 试剂二见光易分解，反应需严格避光。
