关于密度梯度离心有关问题的补充说明（一）
（一）离心管及转头密度梯度制备
① 手工制备；是主要的也是常用的方法
i 阶梯形梯度制备：配置不同密度的梯度液（与离心温度相同），用带恒温装置的阿贝折射仪检测各密度层折射率用于检测密度的正确性，按照由浓至稀薄的顺序分层铺在离心管中；再在梯度液上部或底部铺样品。
ii 线性梯度手工制备：把连续梯度分成（5～10）段不等密度，按照密度的高一低顺序分层铺在离心管中，根据梯度材料不同而在室温中静止存放数小时或过夜；利用梯度材料在重力作用下的浓度扩散形成近线性梯度。
iii 线性梯度冻溶制备；配置平均密度 
的等密度液，放在低温冰箱中冻结（一般过夜或数小时）全部冻结后取出室温溶化，全部溶化后再放在冰箱中冻结，再静置溶化后可以形成近线性密度梯度。
② 自制简单梯度仪制备：取二个直径相同的玻璃烧杯，请灯工联接底部，联通管的 中部加旋塞开关，将最高密度梯度材料和最低密度材料分别置于不同烧杯（注意，二个烧杯中梯度液相加的总容量等于离心管单管梯度液容量）。浓液烧杯中放置螺旋搅拌器，将管道泵的抽出管置于浓杯底部，打开二个杯中间旋塞开关，开动搅拌器及管道泵。抽出至离心管中，直至抽完。这个方法适用于单管容量较大（10ml 以上）的梯度制备、如果管道泵输出有多管分液器，可以用于多管制备，此时二烧杯容量和筹于多管容量之和。
③ 用厂商提供的自动梯度仪制备可以同时制备单管或多管（多至6 管）。如果盛放梯度液的容器直径不同则可以制备曲线梯度，（如高浓度杯直径大，可制备凸指数梯度如低浓度杯直径大，则可制备凹指数梯度。凸指数梯度可提高高密度区分辨率，凹指数梯度可提高低密度区分辨率）
④ 区带转头及连续流转头的密度梯度制备（参考梯度取出第⑦部分说明）
⑤ 利用某些梯度材料在离心过程中自形成梯度的特点制备密度梯度【参考“离心技术讲座”文献第18）】
（二）密度梯度离心后梯度液的取出方法
① 离心管底部穿孔后分滴收集：较大容量注射器针头倒放在空管中（空管内径比离心管外径稍大），离心管顺空管柱下用力刺破管底后松管盖后往下滴液，手工或用计滴（或计时）分部收集器收集后分管作吸光度测量，并绘出容量一吸光度曲线定位。
特点：用于看不清纯样品带的离心；方法简单可行；层次间有少量混浠（特别是低密度液体）影响分辨率；离心管一次使用，成本稍高；适用于薄壁PA，PP， PPCO， PET 管，不适用于PC 管、各种厚壁管、金属离心管及离心瓶；收集后的吸光度测定和容量－吸光度曲线绘制费时、繁复。
② 手工上取：开口管倾斜20°～30°，用定量吸管沿内壁液面处缓缓吸出注入收集管，换吸头再重复吸出，一层层往下收集。
特点；简单可行；一般5ml－40ml 离心管可收集成50～100 管，在容量一吸光度曲践上每收集管有一点。如果梯度离心后会形成三个以上的纯样品带，收集的管数可能要增加到100~200 管才能给绘成比较完整的峰值曲线，和下部穿孔取样一样简单但是非常繁琐，工作量很大；适用于各种离心管、厚壁管、或离心瓶，使用熔封密封管、指压管或快封管时要削去管的肩部以上部分，会影响液柱的整体性。
③ 侧壁穿刺取样：对于可见纯样品带的实验（如质粒DNA，染色体DNA，线粒体等）；可将离心管套在一个开有侧狭缝的空管中用注射器从侧面穿刺进入离心管，缓速抽出。
特点：直接抽出所附要的样品成份；回收率以80％左右；分辨率取决于操作水平；只适用于薄壁的PE，PA，PPCO，PET 管；离心管一次性使用；不适用于不显色的样品。
④ 用特制的取出梯度密封盖，细管插入管底，从上部用蠕动泵泵入高密度排挤液，从密封盖上部侧向开口排出梯度液。梯度取出是从低密度到高密度依次而出。排出口可以联接分光计流动池再接分部收集器，也可以用手工分管收集。
特点：用于开口管，不损坏离心管；密封盖制作比较复什；上部取出次序是从低密度到高密度可以保持较高的分辨率和回收率；一般不用于密封管、快封管和指压管；梯度取出后的流动池连续吸光度测定和联接分部收集器可一气呵成，省时省力。
⑤ 用密度梯度分部制备一收集仪上取：一些厂商提供了自动的多管梯度制备和单管上取收集仪器（如日立的DGF—U），非常适合做开口管的密度梯度上取→分光计流动池吸光度测量→绘制容量→吸光度曲线→自动分部收集的一体化自动取出和测定。自动梯度仪的上取管联接着液面高度探测器，可以自动地在一边往上吸的同时吸管往下移动，它附有管道泵，可以在很大范围内调整抽取速度。
特点：自动化程度高，省时，省力；分辨率和回收率都很好：适用于各种离心管、瓶；用于溶封管，指压管及快封管时只要削去管肩上部一小部分，基本上不影响液柱的整体性；分光计没有流动池时也可以手工收集；仪器还可用于多管（1～6 倍）梯度制备；设备投资稍高。
⑥ 用玻璃毛细管慢慢插入管底，毛细管上部联接蠕动泵软管用蠕动泵抽出再分部收集，或直接联向分光光度计流动池连续测量吸光度并同时绘出曲线，峰值所在即为某几个已纯化的样品所在位置，通过流动池后再用分部收集器或人工收集。
特点：梯度抽出次序是从高密度到低密度，为了减少层间干扰，插入时要缓慢插入和必须缓慢抽出；对各种材料的开口管、厚壁管、离心瓶都可以多次使用（不破损离心管），也可用于快封管、指压管、熔封管（一次性使用管），抽出前须用刀片切去密封口。由于高密度向低密度的抽出往往会引起离心管内不同层次梯度液的混合，降低分辨率，一般不推荐给初次使用者。
⑦ 转头（区带、连续流）密度梯度离心后梯度液的取出：区带转头的梯度制备、加样和梯度取出卸样过程都是在低速运转情况下实现的（2,000~3,000rpm），由特制的密封加样一卸样装置和密度梯度泵来实现密度梯度液的制备和排出。用管道泵输入样品。排出液联到带流动池的分光计后由分部收集器收集。部分超速连续流离心产品（如日本Hitachi 的变频驱动的大容量超速连续流装置CC－40；美国Alfa－Wasserman 公司压缩空气驱动的同类超速连续流装置KII）可以在静止状态下加入梯度液，利用离心机的慢加速把水平梯度转换成垂直梯度然后转头升速至超速（40,000rpm 以下）后连续加样。离心完成后快减速至低转速，慢减速完成转头内液体的垂直梯度向水平梯度转换，停转后从转头下部从部泵出梯度液再联接到分光计流动池检测后自动分部收集。
（三）离心后梯度物质中纯样品区带的检测方法
l 可显色材料（如加E.B. 的质粒DNA 样品带，染色体样品带，线粒体样品带）的直观肉眼观测。
l 某些样品在紫外光照射下显色的直观观察。
l 分部收集后分别用光镜或电镜观察（如细胞、亚细胞构造，病毒等等）。
l 分光光度计流动池（仪器收集）或标准池（人工收集）吸光度测定，容量一吸光度曲线绘制后根据峰位置定位纯样品区带所在的分部收集管。一般核酸，核蛋白体检测用波长260nm；细胞，质膜及亚细胞构造用540nm 都可以获得满意的结果。
l 用放射性同位素标记然后用相应的仪器检测（如液闪计数或γ计数器）。（文献2）
l 用特定的酶标记（如亚细胞构造，细胞器的内膜等）。（文献3）
