四聚体——抗原特异性T细胞检测金标准
实验概要
抗原特异性T细胞在细胞免疫应答中发挥着核心作用，因此定量测定抗原特异性T细胞数量在判定机体细胞免疫功能方面提供重要的信息。传统的抗原特异性T细胞功能检测方法有经典的Cr51释放试验、有限稀释法（LDA）、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）等，但是这些方法或多或少都存在操作繁琐、检测结果误差较大等缺点。根据抗原特异性T细胞上TCR与MHC-多肽复合物特异结合的原理，可以利用Tetramer技术检测抗原特异性T细胞。虽然MHC-多肽单体能与TCR结合，但其亲和力低，解离速度很快，因而不能直接用于特异性T细胞的检测。为解决这一问题，Altmen等于1996年首创了MHC-多肽四聚体技术。其具体原理是借助生物素-链霉亲和素系统，将MHC-多肽复合物四聚化，单个MHC-多肽四聚体分子可与细胞表面的多个TCR结合，从而大大提高了MHC-多肽复合物与TCR的亲和力和稳定性，便于利用流式细胞仪进行检测。与其他技术相比，该技术具有迅速、直接检测抗原特异性T细胞的优点，且灵敏度高，特异性强。即使当体内抗原特异性T细胞水平低于1%，用此技术仍可准确测定其数值。
主要试剂
所需主要试剂：
带有PE/APC荧光标记的MHC-肽四聚体
来自HLA-A0201人群的欲检测细胞／全血
抗-CD8-FITC /其它抗体
红细胞裂解液（Cat# 6910001）
FACS洗涤液（含0.1%叠氮钠和0.1%BSA的PBS）新鲜配制。
实验步骤
标准操作程序——检测外周血中抗原特异性T细胞数量
1. 外周血单个核细胞
1) 分离1×106左右细胞，离心细胞500xg 3分钟，弃上清，细胞沉淀重悬于100μl FACS洗涤液。
2) 在细胞悬液中加入5μl带有荧光标记的MHC-多肽四聚体，室温避光反应20分钟。
3) 加入2ml FACS洗涤液重悬细胞，500xg 3分钟离心弃上清，细胞沉淀重悬于100μl FACS洗涤液。
4) 加入适量的抗-CD8-FITC /其它抗体。在室温继续避光反应20分钟。
5) FACS洗涤液洗细胞1次，500xg 3分钟，细胞沉淀重悬于适量FACS洗涤液中。
6) 样品用细胞流式仪分析。
2. 全血
1) 取抗凝全血100～200μl，加入2～3ml 红细胞裂解液，混匀后室温作用5～10分钟，500xg 3分钟离心弃上清，细胞沉淀重悬于100μl FACS洗涤液。
2) 其它步骤如以上所述步骤2～6进行。
-
焦点事件
-
焦点事件
