光镜下双/多重免疫标记实验——免疫荧光双重标记TRITC-FITC
双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位标记两种或两种以上抗原-抗体复合物，达到在同一细胞或亚细胞水平显示不同抗原成分（定性、定位、定撤），分析不同抗原成分相互间功能的增消关系，操作遵循的原则与要求同单标免疫组化方法。其组合方法多种多样，可根据各实验室现有试剂进行组合，也可购置较为成熟的商品化试剂盒。另外，二种抗体间的种属和表达部位的搭配也很重要。
常用方法可按标记物分为三种类型。
（1）免疫荧光双重标记
（2）免疫酶双重标记
①单酶双底物：HRP-DAB/H2O2（棕色）与 4-CN/H2O2（蓝色）或镍-钴 DAB，AP-萘酚 AS-MX 磷酸盐/坚固红（红色）与坚固蓝（蓝色）；
②双酶双底物：HRP-DAB/H2O2（棕色）与 AP-萘酚 AS-MX 磷酸盐/坚固蓝（蓝色）等。
（3）混合双重标记如酶标记与荧光素标记配伍；胶体金（银）标记与荧光索标记配伍；胶体金（银）标记与酶标记配伍等。
双重或多重标记方法也可按标记抗体分为直接法、间接法、复合物法、聚合物扩增法等；按抗体制备动物来源分为异种动物抗体法与同种动物抗体法；按制备抗体构型分为单克隆抗体与多克隆抗体混合法、单克隆抗体亚类型混合法（如 IgG 与 IgM 亚类组合、IgG1a 与 lgG2b 亚型组合）等；按有否洗脱去除第一重抗原-抗体复合物分为洗脱法与非洗脱法。
一般多采用荧光或酶标间接法，混合试剂，不洗脱。光镜以双荧光或双底物酶标记为多，颜色区别。
来源：免疫组织化学实验技术及应用
| 试剂、试剂盒 | |
|---|---|
| 实验步骤 | 1. 石蜡切片（贴片前的载玻片应预涂不含有荧光色素的黏片剂），厚 5 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，人 PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）。 2. 1％ 人血清白蛋白（HSA）孵育 10 min（亦可用 10％ 正常羊血清代之），不洗。 3. 抗 ACTH 血清（McAb）1:200，孵育 30 min，37℃，湿盒。 4. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4，内含 1％ Triton X-100，下同）洗，10 min×3。 5. 羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温避光反应 1 h。 6. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3（第一重 ACTH-TRITC 标记染色已完成）。 7. 切片逐级乙醇脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在 80℃ 烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定 2～4 h，使第一重染色中二抗的不饱和抗原结合部位（Fab）失活。 8. 切片以 TBS 洗 5 min×4。 9. 1％ HSA（或 10％ 正羊血清）孵育 30 min，室温，湿盒，不洗。 10. 抗 GH 血清（McAb）1:400，孵育 30 min，37℃，湿盒。 11. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3。 12. 羊抗鼠 IgG-FITC 1:100，湿盒，室温避光反应 1 h。 13. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3（第二重 GH-FITC 标记染色完成）。 14. 缓冲甘油封片。荧光显微镜下分别以 546 nm 及 490 nm 波长的激发光观察切片组织内 TRITC 及 FITC 所标示的 ACTH 及 GH 抗原（TRITC-ACTH 阳性细胞呈红色，FITC-GH 阳性细胞呈亮绿色）。 15. 观察及摄影。用彩色底片对切片同一部位用 546 nm 及 490 nm 波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的 ACTH 与 GH 两种抗原。 展开 |
