组织切片的免疫荧光双标记实验
间接免疫荧光显微镜检术可使两种或更多种抗原可以在同一切片,同一时间内被显示出来,可用于(1)细胞标记;(2)免疫荧光筛选干细胞。
实验方法原理 | 通过使用激发波长及发射波长均不相间的荧光染料而进行的。通常限用两种荧光染料,最常见的是罗丹明(绿光激发,发射红光)和荧光素(蓝光激发、发绿光)联合使用。 |
---|---|
实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 当进行双标记实验时,最重要的准则是:第一抗体应为不同类型,从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。但如使用单克隆抗体,这一要求就有可能达不到,当使用单抗时,不同型的抗体如IgG和IgM,可被第二抗体确切区分。但不同亚类(IgG 1和IgG 2)的抗体通常不能被二抗确切区分。
3. 在试图进行双标记实验之前,应进行单标记实验,摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。 |
注意事项 | 1. 当进行双标记实验时,最重要的准则是:第一抗体应为不同类型,从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。但如使用单克隆抗体,这一要求就有可能达不到,当使用单抗时,不同型的抗体如IgG和IgM,可被第二抗体确切区分。但不同亚类(IgG 1和IgG 2)的抗体通常不能被二抗确切区分。 2. 在试图进行双标记实验之前,应进行单标记实验,摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。 3. 在进行双重染色之前,必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验,预实验条件必须与双染条件相同,在观察预实验结果和抗体定位正确后,再进行双染实验。 展开 |
其他 | 组织切片做免疫荧光时,背景色重时的两种情况: 一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色; 二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色。 针对第一种问题有以下几点建议:1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光 2. 切片厚度减薄 3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光 4. 一抗以及二抗漂洗干净(非常重要) 5. 选用高品质封片介质。 针对第二种问题有以下几点建议:1. 曝光时间的控制 2. 暗室操作。 展开 |