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poly(A)+ RNA的制备实验

2019.9.12

           

实验方法原理 大多数的信使RNA(mRNA)都带有poly(A)尾,而结构RNA没有。使用本工作方案,可以将带poly(A)的RNA从rRNA和tRNA中分离出来。
实验材料

RNA

试剂、试剂盒

NaOH 寡聚脱氧胸苷纤维素 poly(A)样品缓冲液 LiCl EDTA TE 乙酸钠

仪器、耗材

离心机 分光光度计 摇床

实验步骤

1.  先用10 ml 5 mol/l NaOH清洗硅化的层析柱,然后用水冲洗。

2.  取0.5 g oligo(dT)纤维素干粉加1 ml 0.1 mol/l NaOH中,倒入柱内,以约10 ml 水冲洗。

 

3.  用10~20 ml 加样缓冲液平衡柱子,至流出液pH约7.5。

 

4  于70℃加热含2 mg 总RNA的水溶液10 min,再用10 mol/l LiCl调节溶液中LiCl至终浓度0.5 mol/l。

 

5.  加RNA溶液至oligo(dT)柱,并以1 ml poly(A)加样缓冲液洗涤,将流出液重新上柱2次以上。

 

6.  用2 ml 中度洗脱缓冲液洗柱子,用盛有2 ml 2 mmol/l DETA/0.1%SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。

7.  按步骤2重新平衡柱子,重复步骤2~4的poly(A)选择吸附和冼脱过程。

8.  调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至0.3 mol/l,加2.5倍体积乙醇,移至2个硅化的离心管中,-20℃放置过夜或干冰/乙醇中30 min。

9.  于4℃ 304 000 g 离心如沉淀RNA。弃去乙醇,晾干沉淀,重溶于150 ul 无RNA酶的TE缓冲液,合并样品。

10.  取5 ul 在70℃加热5 min 后,在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA的质量。

            展开           
其他

来源于《cDNA微阵列技术中内标 Poly (A )+ RNA 的制备》


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