实验室分析仪器--全自动生化分析仪分析参数设置
反应温度
自动生化分析仪通过温度控制系统保持温度恒定,以保证反应的正常进行,其保持恒温的方式有三种:干式恒温器加热、水浴式循环加热、恒温器循环间接加热。恒温控制器可以对25℃、30℃、37℃三种温度进行恒温,根据需要可以任意选择,半自动生化分析仪恒温器属于这种。全自动生化分析仪的温度控制器一般只能控制37℃一种温度,少数也可以控制30℃和37℃两种温度。
反应波长
当测定体系中只有一种组分或混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收波长无重叠时,可选用单波长,如果待测物质有几个吸收峰,可选用吸光度最大的一个波长,或者选择在吸收峰处吸光度随波长变化较小的某个波长。当被检溶液混浊或存在较多的干扰物质时,测定过程中会出现光散射和非特异性光吸收,从而影响测定结果的准确性,此时可用双波长甚至多波长测定,以提高测定结果的准确性,而在实际应用中选择辅助波长主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。由于脂质、血红蛋白、胆红素在较宽的波长范围内有较强的光吸收,常常同测定波长有重叠,此时测得的吸光度包含待测物质的吸光度和干扰物质的吸光度,因此必须选用合适的辅助波长来消除干扰物质的吸光度。辅助波长的设置原则是根据测定波长选择辅助波长,要求干扰物质在测定波长同辅助波长有相同的吸光度。
反应方向
有正向反应和负向反应两种,反应过程中吸光度增加为正向反应,吸光度下降为负向反应。
样品量与试剂量
样品与试剂量的确定一般按照试剂说明书上的比例,并结合仪器的特性进行设置,亦可根据手工法按比例缩减或重新设计,但要考虑到检测灵敏度、线性范围,尽可能将样品稀释倍数大些,以降低样品中其他成分的影响。在样品与试剂量的设置过程中主要应注意以下几个方面:①稀释水量,添加样品稀释水的是为了洗出粘附在采样针内壁上的微量血清,减少加样误差,添加试剂稀释水是为了避免试剂间的交叉污染,两种稀释水的量应在复溶试剂时按比例扣除。如果采用液体试剂盒时因不再用水,无法扣除稀释水量,所以两种稀释水应尽量减少,以免试剂被过量稀释。②最小样品量,即分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量,随着技术的不断改进,仪器的最小样品量逐渐减小,目前有少至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数,从而使仪器的检测范围上限得以扩大。③总反应容量,在不同的分析仪有一个不同的规定范围,在设置的时候样品量和试剂量之和不能超过这一范围。该值受仪器的光路系统所影响,直射式光路由于光束较宽,难于减少所测试反应液体积,集束式光路则是通过一个透镜使光束变窄,可检测低至180μl的反应液混合体,近年来又出现了点光源技术,它的光束更小,照射到样品杯时仅为一个点,可使反应液的量降至120μl。④试剂量/样品量比值,不要为节省试剂而过分地减少试剂用量,因为在终点比色法中,缩小试剂量/样品量比值会降低线性范围,遇高浓度样本会因试剂量不足而使结果偏低。
分析时间
分析时间包括孵育时间、延迟时间、监测时间等,选择不同的分析方法应选择相应的分析时间。
孵育时间选择终点法时设置,在一点终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间,在两点终点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。在设置孵育时间时,有些分析方法要特别注意,如选择溴甲酚绿法测定血清白蛋白时,由于血清中α1-球蛋白、转铁蛋白等也可与溴甲酚绿呈色,尽管其反应速率较白蛋白为慢,但是实际上当血清与白蛋白混合时,“慢反应”已经发生,因此为减少非特异性结合反应,应在溴甲酚绿与血清混合后30s读取吸光度。当选择酶法的Trinder反应测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯时,由于37℃酶反应较慢,因此必须测定这些酶试剂反应达到终点的时间,自动分析仪用试剂盒一般可以在全部加样后5分钟内反应完全,所以应选择分析仪的最大反应时间。
延迟时间选择连续监测法或两点终点法时设置,即在样品与反应试剂(第二试剂)混匀开始至第一个吸光度选择点之间的时间。在连续监测法过程中,当酶与底物混合后需要一定的时间让酶激活,直至线性反应期才能开始监测,有的项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗尽,消除干扰。一般单试剂法只需要30s,常用项目中谷氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶需要特别注意,但是对于双底物反应或需要辅酶参与者,通常为1-3min。
监测时间酶促反应延滞期后,在过量底物的存在下,反应速率加快并达到稳定的阶段,即酶促反应以恒定的速率进行,不受底物浓度的影响,这段时间称为线性反应期或零级反应期,自动生化分析仪的监测时间即为此期。连续监测法在零级反应期至少应监测90-120s或至少4点(3个ΔA),少于3个ΔA不能称为连续监测法,因为不能计算线性度;监测时间过长则容易发生底物耗尽,可测范围变窄。
计算因子
(F值)和实测F值用连续监测法进行酶活性测定时,不需作标准管或标准曲线,根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。先测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(ΔA/min),以U/L代表酶活性浓度时,则可按下式进行计算:
U/L,t℃=△A/min×F==△A/min×V×106/(ε×V×L)
式中V:反应体系总体积(ml);106:将mol换算成μmol;ε:摩尔吸光系数(cm2/mol);v:样品体积(ml);L:比色杯光径(cm)。
当条件固定时,从理论上讲V、v和L均为固定值,ε值为常数,所以F值是恒定的。F值对酶的测定十分重要,过高虽然测定的线性较宽,但重复性差,反之精密度虽好,但检测线性窄,因此应根据实际情况进行合理的设置和应用。但是在临床实际工作中,仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小、比色杯光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会影响指示物的ε值或上述公式中的相关项,因此应在具体仪器条件下,定期检查和实际测定指示物的实测ε值和F值。因为纯NAD(P)H溶液不稳定,所以NAD(P)H的ε值需用葡萄糖己糖激酶法实测,实际操作为将某一浓度的葡萄糖溶液重复5-10次测定,得到相应的一组吸光度A值,求出A¯±s,注意s必须低于规定的批内允许值,再根据下面两个公式分别计算出NAD(P)H的实测ε值和F值:式中C为标准液浓度(mol/L)。其他一些色素源指示物在不同的介质环境中,其ε值会发生程度不等的变化,对5-硫代-2-硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺等这些可得到高纯而稳定的指示物,可将其配制在一定的介质中,按临床标本用的现场试剂和仪器测定吸光度求实测ε值及F值。
线性度
是非线性比率的界线,常用%表示,其计算公式为,式中:k1为连续监测时间2/3内前读数时间的斜率,k2为后2/3读数时间的斜率,k3为总的斜率,一般设置为15%。对一些酶活性项目,可以适当放宽,当不需要设置检查界限时,设置其为0。线性百分数大,说明Δk之间已不成线性;超过极限值说明底物不足,检测结果会变低,应稀释后重测。
底物耗尽限额
选择连续监测法或两点终点法时设置,不同型号分析仪的设计不一样,有的为零点与监测第一点吸光度的差额,有的为吸光度上升或下降至吸光度(MAX-OD/MIN-OD)的数值。超过限额说明样品的酶活性非常高,底物消耗太快,在仪器程序规定的线性反应期内吸光度的变化往往不代表真正的酶活力,导致结果偏低,该样品应稀释一定的倍数重新测定。此参数对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要,下面以丙氨酸氨基转移酶为例简述设置MIN-OD的步骤,选择一份高活性酶的混合血清,用生理盐水稀释,得到一组从低浓度至高浓度的丙氨酸氨基转移酶溶液;把这一组溶液按仪器设定的程序进行测定,并打印出反应曲线;从曲线中可以发现当酶活力达到一定临界浓度时,该临界浓度的反应曲线在连续监测时间内成线性,但是在监测时间后成非线性,即连续监测时间的最后一个读数点正好是线性与非线性的临界点,所以该点的吸光度是在连续监测时间内酶促反应没有发生底物耗尽时所能达到的最小吸光度值,这个最小吸光度值也就是MIN-OD。当酶活力高于上述临界浓度时,反应曲线在连续监测期内已不呈线性反应,有些仪器自动选择弹性速率功能,能自动选择反应曲线上连续监测期内仍呈线性的吸光度数据计算结果,使酶活性测定的线性范围得以扩大,可以减少稀释及重测次数、降低成本。
试剂吸光度上限、下限
试剂吸光度上限为正向反应用,可参考试剂盒说明书数值折算成所用比色杯的光径。如试剂盒要求上限为0.4,比色杯光径0.6cm,则试剂吸光度上限设置为0.24。试剂吸光度下限为负向反应用,设置法同试剂吸光度上限。每种试剂都有一定的空白吸光度范围,试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质,此时应更换合格试剂。
线性范围
试剂盒的线性范围与试剂质量、反应时试剂/样品比有关,应实测试剂盒的线性范围。当样品浓度低于线性下限应增加样品量重测,而高于线性上限则应稀释后重测。使用任何一种方法测定某待测物时,待测物都有一个可测定的浓度或活性范围,样品结果若超过此范围,仪器将显示测定结果超过线性范围的提示,多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。
校正方法
仪器内的设置的校正方法一般包含二点校正、多点校正、非线性校正等。二点校正是指用一个浓度的标准品和一个试剂空白进行校正的方法,该法要求反应必须符合朗伯-比尔定律,即标准曲线呈直线。多点校正是多个具有浓度梯度的标准品用非线性法进行校正,适用于标准曲线呈各种曲线形式的项目,如多数的免疫浊度法。非线性校正包括对数校正、指数校正、量程法校正等,标准曲线呈对数或指数曲线特征的项目可选择所对应的方法校正,量程法则是根据标准曲线上每两点间浓度与吸光度的关系计算待测物的浓度。
线性回归方程
用于校准不同分析方法间测定结果的一致性,在定标后即可求得,有斜率和截距两个参数,a为曲线在纵轴上的截距,b为曲线的斜率。
