酸性α醋酸萘酯酶染色法
实验概要
本实验介绍了酸性α醋酸萘酯酶染色法的原理、操作流程及注意事项等。
实验原理
淋巴细胞内含有许多种酶，如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthyl acetate esterase，ANAE)，在弱酸性条件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色法可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。
主要试剂
1. 25%戊二醛溶液(固定液) 在0.1mol/L pH值7.4磷酸盐缓冲液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml混和，置4℃冰箱保存备用。
2. 副品红液 将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。
3. 4%亚硝酸钠溶液 取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。
4. 六偶氮副品红溶液 取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。
5. α醋酸萘酯溶液：
α醋酸萘酯2g 乙二醇单甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。
6. 0.067(1/15)mol/L pH值7.6磷酸盐缓冲液：
甲液 KH2PO4 9.08g加蒸馏水至1，000ml
乙液 Na2HPO4 9.74g加蒸馏水至1，000ml。(如为Na2HPO4•12H2O则称取23.22g)
取甲液13ml，加入乙液87ml，即为0.067mol/L pH值7.6磷酸盐缓冲液。
7. 反应液
0.067mol/L pH值7.6磷酸盐缓冲液89ml 六偶氮副品红 6ml(缓慢加入) α醋酸萘酯液25ml(缓慢加入)
8. 甲基绿染色液充分混匀，调pH值5.8～6.0，临用前配制。
甲基绿1g 蒸馏水100ml 置37℃溶解，冰箱保存备用。
实验步骤
1. 分离单个核细胞 取家兔肝素抗凝血1ml加入Hank's液1ml，加入到含有2ml淋巴细胞分层液(比重1077±0001)的离心管中，以2 000 r/min离心30min。洗涤后，加少量Hanks液，摇匀。
2. 制片 取上述细胞悬液1滴，加到洁净玻片上，涂片，自然干燥。
3. 固定和染色 将制备的细胞涂片用25%戊二醛液4℃固定10min，流水冲洗，待干。将玻片置于反应液内，37℃孵育1h，取出用水冲洗，待干。
4. 复染 用甲基绿染色液染1min(或瞬时染色)，水洗，吹干。油浸镜下观察计数。
注意事项
1. 不同质量的试剂，尤其是偶氮染料对反应产物的颜色、鲜艳程度、颗粒粗细和定位清晰程度等影响很大，应加注意。
2. 由于本反应为酶化学反应，反应非常灵敏，各种条件应严格掌握。尤其是试剂的pH值要求准确，需用精密pH试纸或pH计测定。
3. 配制反应液时，各溶液混合，必须边摇边缓慢加入，若滴入过快，可出现沉淀，影响染色结果。
4. 制片过程中，标本要求尽快固定、干燥和冲洗。若时间过长，可影响酯酶活性。
5. 涂片插入染色缸时，要注意必须将标本面与反应液接触，切勿将标本面紧贴缸壁，以免影响染色反应。如片子较多，反应液相对减少，会使阳性率减低。
染色后冲洗不宜过久，防止酶反应产物的红色消减，造成标本观察困难。
