水迷宫和敞箱实验相关：耐力训练对老龄大鼠学习记忆...
水迷宫和敞箱实验相关：耐力训练对老龄大鼠学习记忆和焦虑样行为的影响
摘要：目的：通过建立老龄大鼠耐力运动训练模型，观察耐力训练对老龄大鼠学习记忆能力和焦虑样行为的影响，并探讨了9周游泳训练后进行一次力竭性运动的血乳酸浓度与运动能力之间的关系．方法：将２７只健康雄性ＳＤ大鼠按年龄分为青年对照组（ＹＣ，ｎ＝９）、老龄对照组（ＯＣ，ｎ＝９）和老龄运动训练组（ＯＥＸ，ｎ＝９）．ＹＣ、ＯＣ组自然饲养，不加干预，ＯＥＸ组大鼠进行为期９周的游泳训练．采用Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试学习记忆能力，旷场实验测试焦虑样行为．使用日本京都ＬＴ－１７１０型血乳酸仪测定血乳酸浓度．结果：１、９周游泳耐力训练后ＯＥＸ组大鼠力竭时间明显长于ＯＣ组（Ｐ＜０．０５）．２、ＯＥＸ组力竭后血乳酸含量明显低于ＯＣ组（Ｐ＜０．０１）．３、Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验结果显示：定位航行实验ＯＥＸ组潜伏期明显小于ＯＣ组（Ｐ＜０．０５）；空间探索实验ＯＥＸ组大鼠穿越原平台位置的次数多于ＯＣ组，但结果无统计学意义．４、旷场实验结果显示：垂直运动得分、理毛次数３组之间差异不显著；ＯＥＸ组水平运动得分明显低于ＹＣ、ＯＣ组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５），中央格停留时间明显延长（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５）．结论：１、长期耐力训练能明显提高老龄大鼠耐力水平．２、长期耐力训练可以改善老龄大鼠学习记忆能力，降低焦虑水平．
关键词：耐力训练；学习记忆；焦虑样行为
学习和记忆是动物和人类生存不可或缺的重要脑功能．近年来，随着我国老龄化进程的不断加快，如何使老龄人群拥有高质量的生活已经成为全社会关心的重要问题．研究表明，老年人的学习、记忆能力随着年龄的增加而不断下降．老年痴呆已成为最常见的痴呆类型，我国６５岁以上人群的老年痴呆患者为４．８％；老年性痴呆作为老年期多发疾病已成为不容小视的事实．研究表明，运动可以限制（β－淀粉样蛋白，Ａβ）的形成并促进其降解；通过诱导神经生长因子（ＮＧＦ）和脑源性神经营养因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）的适应性变化影响长时程增强（Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＬＴＰ），促进海马区神经再生，从而防治与阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）有关的大脑海马区功能下降．大量证据表明，规律而合理的体育锻炼能有效延缓老年人学习和记忆能力的衰退，有助于提高老年人生活质量，但运动影响学习记忆的确切机制还远未阐明．影响老龄人群生活质量的另一个常见心理原因是焦虑．随着年龄的增长，老年人的身体机能逐渐下降，他们组织和参与活动的能力也大大降低，身体疾病和心理压力逐渐增多，这是导致老年人产生焦虑情绪的主要原因．焦虑作为心境，是老年人最经常体验的一种负性情绪状态．老年人长时间处于较高的焦虑水平，对老年人的心理健康具有着潜在而深远的影响，容易引发心理和行为问题．目前，对改善焦虑情绪的研究多集中在药物层面．运动可以看作一种刺激或应激，对脑的可塑性产生影响．合理的运动不仅可以减缓老年人的机体衰退，提高新陈代谢能力，而且能有效改善情绪状态．本研究对老龄大鼠进行９周耐力训练，通过行为学测试观察耐力运动训练对老龄大鼠学习、记忆和焦虑样行为的影响，初步探讨其内在规律，旨在引导老年人通过合理有效的运动锻炼和健康的生活习惯实现身心健康，为老年人科学健身提供理论和实践依据．
１ 材料与方法
１．１ 实验动物与分组
青年（３月龄）健康雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ大鼠９只，老龄（１５－１６月龄）健康雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ大鼠１８只，由苏州大学实验动物中心提供．适应性喂养１周后，将老龄大鼠随机分为２组：老龄安静对照组（ＯＣ，ｎ＝９）、老龄运动训练组（ＯＥＸ，ｎ＝９）（图１）；青年大鼠作为青年对照组（ＹＣ，ｎ＝９）．动物分笼喂养，自由饮食．光照时间８：００ａ．ｍ．－８：００ｐ．ｍ．，室温２２~２．５℃，相对湿度４５％－５５％．图１ 实验流程图
１．２ 实验仪器设备
日本京都ＬＴ－１７１０型便携式血乳酸测定仪；SuperMaze动物行为学视频分析系统，上海欣软信息科技有限公司；旷场实验视频分析系统，上海欣软信息科技有限公司．
１．３ 动物运动训练方案
运动训练组大鼠在玻璃缸游泳池中训练，游泳池水深５０ｃｍ，超过大鼠身长的２倍，水温３０－３２℃，每次游泳时间固定在下午３点到５点之间，第１周进行３次适应性训练，从第２周起大鼠每周训练５天，每天训练３０ｍｉｎ，共９周．
１．４ 力竭测试大鼠尾部负重，放入水温（３０±１）°Ｃ、水深５０ｃｍ的水槽中游泳，初始负荷为体重的１％，每３分钟增加大鼠自身体重的１％，记录大鼠从入水至运动疲劳发生时的游泳时间．大鼠头部没入水面以下１０ｓ不再上浮判定为疲劳，记录疲劳时间．
１．５ 学习和记忆能力测试
１．５．１ 实验装置水迷宫实验在一个直径为１２０ｃｍ，高５０ｃｍ，水深４０ｃｍ的圆形游泳池内进行，游泳池由黑色玻璃纤维制成，水温保持在２６℃左右，在池壁北（Ｎ），南（Ｓ），东（Ｅ）和西部（Ｗ）分别以４种不同形状的图形作为标记，标志动物的入水出发点，这些标记将水池分为Ａ、Ｂ、Ｃ及Ｄ ４个同等象限，在离池壁３０ｃｍ的Ｄ象限正中处放一个直径为９ｃｍ、高３８ｃｍ的透明圆形平台做为目标平台，水面高度不得高于平台顶２ｃｍ．水迷宫上方安装有摄像机，用来同步记录大鼠运动轨迹，采用美国的ＡＮＹ－ｍａｚｅ软件记录整个过程．实验期间水迷宫外参照物保持不变．
１．５．２ 检测方法
１．５．２．１ 定位航行实验
测量大鼠获取经验（学习）能力的一种方法．实验前１天将大鼠放入水中自由游泳２ｍｉｎ，使其熟悉实验环境并观察其游泳姿势
有无异样．定位航行实验部分包括３天每天４个连续的训练次数，动物面对池壁放入池中，允许其自由游泳以找到被水漫过的平台．每次训练从东、南、西、北中随机选择一个入水点，每一次训练所有大鼠入水点相同；同一只大鼠在每天的４次训练中分别有４个位于不同象限的入水点．记录大鼠找到平台的时间，即潜伏期（Ｌａｔｅｎｃｙ）．如果大鼠在６０秒内没有找到平台，轻轻地引导它上平台，潜伏期记为６０ｓ，大鼠每次爬上平台或被引上平台后，让其在平台上休息１５ｓ，如果大鼠突然逃跑，允许它继续留在平台１０ｓ．计算每一时间段内４次潜伏期的算术平均值做为最后的学习成绩。
１．５．２．２ 空间探索实验
测量大鼠保存经验（记忆）能力的一种方法，检测大鼠学会寻找平台的本领后对水中平台位置记忆的功能．在最后一次训练２４小时后撤去水中平台，然后同定位航行实验的步骤一样，每天４次，但只测试１天，实验中要保证同一只大鼠在４次测试中分别有４个位于不同象限的入水点．记录大鼠在６０ｓ内穿越原平台象限相应位置的次数．
１．６ 焦虑样行为测试
１．６．１ 实验装置
敞箱装置由不透明材料制成，底面为１００ｃｍ×１００ｃｍ的正方形并被等分成１６个等边方格，周围有高４２ｃｍ的墙壁，敞箱中央区域的正上方固定有摄像机，由与之相连接的的旷场实验视频分析系统自动记录大鼠的活动轨迹和位置．
１．６．２ 检测方法
旷场实验（Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ）又称敞箱实验，用来观察实验动物神经精神变化，是评价实验动物进入开阔环境后的各种活动、探索行为与紧张度的一种方法．实验在安静的环境下进行，将每只大鼠放入箱内底面中心方格内，同时进行摄像和计时，观察大鼠５分钟内在中央格停留的时间（Ｔｈｅｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｑｕａｒｅ）、穿越的格子数（Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｓｑｕａｒｅｓ，四爪均进入的方格方可计数，为水平运动得分）、后肢直立的次数（Ｔｈｅｔｉｍｅｓ ｏｆ ｒｅａｒｉｎｇ，两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动的计数（Ｔｈｅ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｇｒｏｏｍｉｎｇ，梳毛次数）．实验后，将大鼠取出，清理干净箱底和四壁，并用７５％的酒精擦拭以除去前一只大鼠的气味，更换大鼠，继续实验．
１．７ 数据统计分析
所有数据用平均数±标准差表示，采用Ｇｒａｐｈ－ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０软件进行统计学分析．力竭测试结果采用单因素方差分析，学习和记忆测试结果采用重复测量设计的方差分析和卡方检验．
３ 分析与讨论
体育锻炼可以促进老年人身心健康，尤其对老年人的心理健康方面有不可替代的作用．一些研究发现运动能改善老龄动物学习记忆，降低焦虑水平，但这一效益的潜在机制仍远未阐明．在比较了主
动运动和强迫运动的差异之后，本研究选择了游泳训练的方法，因其具有更好的可操作性和可控制性（运动强度、时间），且大鼠天生就是“游泳能手”．本研究对老龄大鼠进行９周游泳耐力训练，通过行为学方法测试学习记忆能力和焦虑水平，并测定血乳酸值，结果发现，长期游泳运动训练显著提高了老龄大鼠学习记忆能力，降低了焦虑水平．
３．１ 长期耐力训练提高了老龄大鼠耐力
乳酸在运动医学上有“训练的标尺”的美称，乳酸在血液中含量高低是评价机体疲劳程度的重要标志之一．乳酸的产生和积累效率与运动强度和持续时间有关．本实验通过逐级递增负荷游泳力竭测试，分别测得ＹＣ、ＯＣ、ＯＥＸ组的力竭时间和即刻乳酸值，发现ＯＥＸ组的耐力成绩明显优于ＯＣ组，且血乳酸水平显著低于ＯＣ组，表明游泳运动训练提高了老龄大鼠耐力，这可能与长期的耐力训练可以增强血液中堆积乳酸的利用率有关．
３．２ 长期耐力训练改善了老龄大鼠学习记忆能力
学习和记忆是人类进行各种智力活动的基础．学习是指新行为的获得和发展，记忆是通过学习获得的经验的保持和再现．学习和记忆是动物和人类生存不可或缺的重要脑功能，是神经科学研究中的重要问题．衰老是人和动物都要遵循的自然规律，在衰老过程中，不仅机体出现各种功能下降，学习记忆功能也随之老化，减退明显．水迷宫是一种较好地评定动物空间学习记忆能力的方法，本实验应用Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验检测９周游泳运动训练对老龄大鼠的学习记忆能力的影响，发现ＯＥＸ组寻找到目标平台的潜伏期与其他组比较明显缩短，撤去平台之后穿越原平台位置的次数与ＯＣ组比较有增多趋势，但差异不显著．运动对于保持脑健康具有重要作用，适宜的体育运动有助于终身保持脑健康和可塑性．Ｐｉ－ｅｔｒｅｌｌｉ Ａｄｅｎ等人研究发现，规律、长期的跑台耐力训练可以对老龄大鼠具有神经保护；与不运动大鼠相比，耐力训练组大鼠记忆成绩明显提高．本结果亦显示９周游泳运动训练可明显提高老龄大鼠的学习能力并在一定程度上改善记忆能力．
３．３ 长期耐力训练降低了老龄大鼠焦虑水平
焦虑是一种预期反应，面对预先知道且不可避免的、即将发生的应激性事件，以恐惧、担心、紧张等精神症状为主要表现，核心症状为担忧．适当运动是缓解应激的有效方法，能够改善情绪、减少状态性焦虑．研究表明，规律、适量的身体运动有利于大脑健康，包括改善心理状态和认知功能，增强心理幸福感、增强抗抑郁药和抗焦虑药的使用效果并且降低患老年痴呆的风险．此外，大强度运动比中、低强度运动更能表现出脑部的活动增强，更能加快消除焦虑、不安等情绪．Ｐｉｔｔｓ ＦＮ Ｊｒ认为在训练中乳酸的产生是引起焦虑反应的可能原因，而本实验在测试大鼠焦虑样行为的旷场实验中发现，ＯＥＸ组大鼠的水平得分与中央格停留时间明显高于ＯＣ组，这反映ＯＥＸ组大鼠的焦虑样行为明显减少；耐力训练对改善焦虑样行为有一定作用，这或许与机体对乳酸的利用增强有关．此外，本实验仅采用了小强度耐力训练的方法，未进行中强度、高强度的训练，在上述的训练条件下，老龄大鼠的血乳酸浓度变化如何，是否与焦虑样行为有一定的相关性，这些还有待于进一步研究．旷场实验（Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ，ＯＦＴ）又称敞箱实验，是一种评价啮齿类实验动物自主运动行为、探究行为与紧张度的一种方法，现已经广泛应用于帕金森病、抑郁症、焦虑症等神经、精神疾病以及中枢药物评筛的研究中．本实验通过旷场实验观察各组大鼠的焦虑水平．其中，水平活动、中央格停留时间、梳毛次数反映动物的焦虑情况，垂直活动反映动物对周围环境的不确定性和对周围环境中可能存在的危险性的观察．
目前，关于运动对焦虑的作用还存在争议．在运动效果方面，Ｃｏｎｎ等人通过ｍｅｔａ分析认为有氧运动可以降低健康人的焦虑症状，但对已经确诊患上焦虑障碍的人没有改善效果．Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ等人认为目前的证据还不足以证明有氧运动可以做为改善焦虑障碍的有效手段，且没有证据表明有氧运动一定比无氧运动改善焦虑更有效．在运动时间、强度方面，Ｈｅｒｒｉｎｇ等人通过运动前后焦虑测量量表比较发现，短期的耐力训练可以改善广泛性焦虑状态．Ｐａｔｋｉ等人报道对大鼠进行４周中等强度跑台训练，降低了创伤后应激障碍大鼠的焦虑样行为．不同的活动强度和活动方式对焦虑水平的变化会产生影响，此外，年龄对与焦虑相关的行为也有影响．目前对长期耐力运动对老年人的焦虑影响的研究较为少见，本实验研究了长期耐力训练情况下的大鼠焦虑水平，结果未发现游泳运动训练后各组大鼠梳毛次数有显著性差异，这可能与实验样本数量少有关；垂直得分各组之间统计亦无统计学差异，说明各组大鼠对周围环境的探索行为无显著差异；水平得分和中央格停留时间ＯＥＸ组同ＯＣ及ＹＣ组比较明显增多，可见年龄的增长可能对焦虑有一定减轻作用，而耐力训练又可以进一步减轻老年人的焦虑情绪．大量研究表明，不适应的运动或剧烈运动可引起氧自由基与抗氧化系统之间的失衡，导致活性氧生成增加，造成机体氧化损伤．
最近的研究表明，丰富环境可以增强神经可塑性，改善包括学习记忆能力在内的认知功能．适宜的运动可以做为一种丰富环境的方式改善脑的功能与健康．综上所述，耐力训练可以改善老龄大鼠学习记忆能力，降低焦虑水平，但运动是如何发挥上述神经保护作用的？其内在机制有待于进一步研究．此外，不同运动负荷对衰老期学习记忆和情绪的影响也有待于深入研究．
４ 结 论
（１）长期耐力训练提高了老龄大鼠耐力．
（２）长期耐力训练改善了老龄大鼠学习记忆能力，降低了焦虑水平。
