流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群（四）
从Rostaing等[2]发表流式细胞术检细胞内细胞因子的方法后，陆续有人研究了流式细胞术检测细胞内因子方法的可行性及重复性等问题。虽然活化T淋巴细胞有各种各样的方法，如：PMA、PHA、Con
A、CD3、CD2和CD28等。但是目前公认的较好的方法仍然是PMA和钙离子载体的联合刺激。研究发现在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表达就达到一个较高的水平，因而适合进行流式检测。我们的研究结果发现，人的外周血T淋巴细胞表面的CD4表达受PMA的影响非常大，在刺激后2h即明显下降，4h已经难于区分CD4阳性T淋巴细胞，因此这就难于确定Th细胞。虽然国内部分学者认为在PMA的刺激下，CD4仍可以维持一定的表达[3,4]，但是我们的结果和国内部分[5]及国外的大多数[2,6]研究结果表明，在PMA的刺激下，CD4表达迅速下调，此时采用CD4来标记Th细胞已经不能准确的检测Th细胞，因而不能准确的反应Th1和Th2细胞的比率。而CD3和CD8的表达受PMA等刺激因子的影响很小，因此，目前，国外推荐的方法是采用CD3和CD8设门，区分CD4阳性T淋巴细胞。由于多色荧光标记流式检测技术的发展，笔者认为采用4色标记技术检测人Th细胞是目前最好的方法。这种方法可以实现一个检测管，同时观察Th1细胞和Th2细胞；可以检测CD8＋细胞的细胞内因子的表达；还可以观察IL-4和IFN-γ双阳性细胞。一个检测管同时染色，节约了抗体和劳动量等检测成本。但是由于多色染色技术对流式的操作者有较高的要求，实施过程要注意补偿调节等具体问题，我们曾经采用CYC标记的CD8和APC标记的CD3联合设门区分Th细胞，由于CYC和APC在BD公司的流式细胞仪上，仪器的补偿调节非常困难，最终放弃该方法，改用PerCP标记的CD8才解决这一问题。目前，国内一些流式细胞仪型号相对落后，不能进行4色染色标记技术，笔者认为可以采用双管标记检测法，即采用CD3、CD8和IFN-γ3色标记一管用于检测Th1细胞；采用CD3、CD8和IL-4
3色标记一管用于检测Th2细胞。采用这种方法的缺陷是每个样品检测管数增加，造成检测成本增高，而且不能同时观察IL－4和IFN-γ双阳性细胞。国外有报道采用IFN-γ、IL-4和CD3进行3色标记[7]，这种方法只能观察T淋巴细胞表达的细胞因子的变化，不能区分CD4＋和CD8＋细胞，笔者认为是一种不可取的方法。
我们在Balb/c小鼠实验发现在PMA的刺激下，CD4表达虽然下调，但是其表达持续时间比人的持续时间明显增长，在刺激8h后，仍然能维持一个较高的水平，因而能够有效的区分Th细胞。因此，在Balb/c小鼠采用CD4和IFN-γ、IL-4进行3色标记技术就能有效的检测Th细胞亚群。当然由于CD3和CD8的表达受PMA的影响很小，采用CD3、CD8和IFN-γ、IL-4进行4色标记技术也非常有效。另外，由于CD4不仅在T细胞上表达，还在单核细胞上表达，单独用CD4设门容易受单核细胞的干扰，解决这个问题的一个办法就是采用FSC和SSC散点图来设门区分单核细胞和淋巴细胞，采用CD4直方图区分CD4阴性和阳性细胞，最后采用既位于淋巴细胞区，有位于CD4＋区的细胞来定义为Th细胞，这样可以有效的避免单核细胞的干扰。当然采用4色标记也是一种非常有效的避免单核细胞干扰的方法。
由于T淋巴细胞表达的因子非常多，检测其它细胞因子可以参照检测IL-4和IFN-γ的方法进行。凡是采用PMA等作为刺激剂的检测方法均应考虑到PMA等刺激剂对于细胞表面抗原表达的影响，从而选择最佳的荧光抗体标记，这是进行准确的检测的基础。
参考文献
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