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UPLC/MS/MS测定肉类和乳品中的氨基糖苷类抗生素

2021.3.15

　　氨基糖苷类抗生素会作为兽药被用于治疗产肉和产乳动物，因此需要一种分析其在这些商品中残留的有效分析方法。这类抗生素给残留分析提出了巨大的挑战。与其他大多数抗生素不同，这些化合物无法使用乙腈或其他有机溶剂从组织或乳品中萃取出来。在研究中，使用含有三氯乙酸(TCA)的水性缓冲液将氨基糖苷类抗生素从肉类组织或乳品中萃取出来。加入TCA能够使蛋白质沉淀并抑制蛋白与这些分析物结合。进行LC/MS分析前，利用有效的固相萃取(SPE)净化操作除去残留的TCA，尽量减少共萃取干扰。通过使用Oasis HLB(高效、水可浸润性反相吸收剂)，在牛奶和肉中可获得良好的固相萃取收率和净化效果。在随后的分析中，使用ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱，在反相离子对模式下，可获得出色的UPLC®分离性能。七氟丁酸(HFBA)用作离子配对试剂。该试剂具有挥发性且能与质谱法结合使用。

　　在全球范围内，氨基糖苷类抗生素在乳品中的最大残留限量(MRL)一般范围是100 ~ 1000 µg/kg，如图1所示。本应用纪要提供了一种适用于测定牛奶和牛组织中氨基糖苷类抗生素残留在ppb水平的方法，该方法一部分是由参考文献1和参考文献2中的方法发展而来。

　　实验

　　UPLC条件

　　系统： ACQUITY UPLC

　　色谱柱： ACQUITY HSS PFP 2.1 x 100 mm，1.8 µm 部件号186005967

　　进样量： 30 µL

　　温度： 35°C

　　流动相A： 20 mM HFBA水溶液

　　流动相B： 20 mM HFBA乙腈溶液

　　流速： 0.50 mL/min

　　梯度： 20% B初始条件，7分钟内线性梯度增至80% B，保持8分钟，浓度降回至20% B，持续8.1分钟。重新平衡，保持10分钟。

　　质谱条件

　　质谱仪： ACQUITY TQD

　　模式：正离子电喷雾(ESI+)

　　毛细管电压：3.0 kV

　　萃取锥孔电压：3.0 V

　　离子源温度：130 °C

　　锥孔气体流速：20 L/h

　　脱溶剂温度： 450 °C

　　脱溶剂气体流速： 900 L/h

　　碰撞气体：氩气，流速0.20 mL/min

　　表1汇总了本研究中使用的锥孔和碰撞参数和多反应监测(MRM)转换。

　　样品制备

　　萃取缓冲液 (10 mM NH4OOCH3/0.4 mM Na2EDTA/1% NaCl/2% TCA):

　　将0.77 g乙酸铵(NH4OOCH3)置于1L的容量瓶中。加入大约900 mL试剂水，溶解。使用1 N HCl或1 N NaOH将pH值调节至4.0。加入0.15 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA.2H2O)、5 g氯化钠(NaCl)和20 g三氟乙酸(TCA)。充分混合，使固体溶解，加试剂水至刻度。

　　初步萃取：

　　将2 g均匀的牛组织或10 mL牛奶置于50 mL离心管中。加入20 mL萃取缓冲液，涡旋10秒钟，然后充分震摇1分钟。将样品在4000 RPM下离心5分钟，收集上清液。按需要使用稀HCl或NaOH将上清液pH调节至6.5±0.5。

　　SPE净化：

　　本研究使用Oasis HLB 96孔板(30 mg)。如有需要，可使用一根1 cc/30 mg的萃取柱。先后使用1.5 mL甲醇、1.5 mL水,平衡板孔或萃取柱。将流速设置为1 mL/min或更低。加入初步萃取得到的pH值调节后的上清液，对于组织样品，加入1 mL上清液，对于乳品样品，加入1.5 mL上清液。以1 mL水清洗。用0.5 mL 10:5:85的甲酸/异丙醇/水洗脱。加入1.5µL HFBA，使用UPLC/MS/MS进行分析。

　　结果与讨论

　　图2是由加标牛奶样品得到的重现的UPLC/MS/MS图谱。相同的条件也可用于牛肉样品的分析。

　　表2(乳品)和表3(肌肉组织)显示加标实验得到的结果在。新霉素(B和C)和庆大霉素(C2a和C2)

　　以同份异构体形式出现并得到部分分离。对这些样品的峰面积进行加和，以便进行定量分析。

　　回收率的测定方法是将样品制备前加到样品基质中的标准品的MRM峰面积与在所有样品制备步骤完成后加到样品基质中的标准品的峰面积进行对比。

　　肉类的基质效应低于30%，乳品的基质效应低于12%。与其他被使用的诸多抗生素兽药不同，氨基糖苷类抗生素不能使用有机溶剂从动物组织和相关样品中萃取出来。但是，这些化合物可以使用水性缓冲液有效地从组织中萃取出来。该萃取缓冲液包括促进蛋白质沉淀的试剂(TCA)。

　　Oasis HLB固相萃取方法使用有机溶剂含量低的洗脱液，与其他甲醇型洗脱液相比(使用甲酸/甲醇洗脱的基质效应大于50%)可使净化效果得以提高。很明显，使用水性洗脱液洗脱氨基糖苷类后，吸附剂上能保留大量的基质干扰成分。

　　选用离子对反相色谱模式UPLC分析。通过使用20 mM七氟丁酸作为离子对试剂实现峰形和灵敏度最佳平衡。也考虑了使用亲水性相互作用色谱的UPLC分析，但是，峰形并不如所选方法得到的峰形尖锐。另外，亲水性相互作用色谱模式的缺点是标准品和样品的稀释剂应当为乙腈。本应用纪要中提供的优化的固相萃取法提供水性样品进样，更适于反相色谱分析。

　　结论

　　■使用针对离子对反相色谱的ACQUITY UPLC HSS PFP分析色谱柱可获得出色的UPLC性能。

　　■七氟丁酸(HFBA)是一种用于UPLC分析的有效离子对试剂。

　　■提出了从牛肉和牛奶中萃取氨基糖苷类抗生素的简便程序；一个操作人员每天即可轻松分析20个样品。

　　■提出了使用Oasis HLB 96孔板的优化的固相萃取方法。牛奶样品分析的检测限为10 ppb，牛肉样品分析检测限是50 ppb；对于在该水平的所有分析物，分析信噪比大于100:1。

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