Southern杂交分析原理和操作
【原理】
Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
一．基因组DNA的限制酶切
【操作】
DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性内切酶(lOU /μl)
5.0μl、加ddH2O至50μl,在最适温度下消化1～3h。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6h己没有必要。或者放大反应体积,或者补充酶再消化。如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。消化后的DNA
加入1/10体积的0.5mol/L
EDTA,以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。
二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
【操作】
1.制备0.8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2.
电泳电泳样品中加人6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。1～2V/cm,DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄人刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。
三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物
【操作】
1.碱变性 室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
2.中和 将凝胶转移到中和液15min。
3.转移 按凝胶的大小剪裁 NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记,水浸湿后,浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman
3mm滤纸作为盐桥,再按凝胶的尺寸剪3～5
张滤纸和大量的纸巾备用。按图8-9所示进行转移。(转移过程一般需要8～24h,每隔数小时换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。)
4.转移结束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液数分钟,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张滤纸之间，80℃烘2h,然后将NC膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处。
四.探针标记
【操作】
（随机引物试剂盒提供的标记步骤）
1. 取25～5Ong模板DNA于0.5ml离心管中,100℃变性5min,立即置冰浴。
2. 在另一个0.5时离心管中加入:Labeling5×buffer 10μl(含有随机引物)，dNTPmix2μl(含dCTP、
dGTP、dTTP各 0.5mmol/L)，BSA(小牛血清白蛋白)2ul， [α-32p]dATP 3μl，Klenow 酶 5U。
3. 将变性模板DNA 加入到上管中,加双蒸水至50μl,混匀。室温或37℃1h。
4. 加50μl终止缓冲液终止反应。标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于α-32P的半衰期只有14天,以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl。
五．杂交
【操作】
1. 预杂交
NC膜浸入2×SSC液中5min,在杂交瓶中加入杂交液(8cm×8cm的膜加5ml即可),根膜的背面贴紧杂交瓶壁,正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中,使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA
(已溶解在水或TE中)100℃加热变性5min,迅速加到杂交瓶中,使其浓度达到100ug/ml。杂交4h。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点,降低杂交背景、提高杂交特异性。
2．杂交 倒出预杂交的杂交液,换上等量新的已升温至42℃的杂交液,同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min,使其变性,迅速加到杂交瓶中。42℃ 杂交过夜。
六．洗膜与检测
【操作】
取出NC膜,在2×SSC溶液中漂洗5min,然后按照下列条件洗膜
2× SSC/0.1% SDS, 42℃, l0min
1× SSC/0.1% SDS, 42℃, l0min
0. 5×SSC/0.1% SDS, 42℃, 10min
0.2×SSC/0.1% SDS, 56℃, 10min
0.1×SSC/0.1% SDS, 56℃, 10min
在洗膜的过程中,不断振摇,不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明,当放射强度指示数值较环境背景高1～2倍时,是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点,都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC液中2min,取出膜,用滤纸吸干膜表面的水分,并用保鲜膜包裹,注意保鲜膜与
NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上,放入暗盒中(加双侧增感屏),在暗室的红光下,贴覆两张X线片,每一片都用透明胶带固定,合上暗盒,置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间,一般在1-3天时间。洗片时,先洗一张X线片,若感光偏弱,则再多加两天曝光时间,再洗第二张片子。影响
Southern杂交实验的因素很多,主要有:DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。
