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PCR 反应体系有哪些?

2021.5.17

  1. 缓冲液

  标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl,其 pH 为 8.3-9.0(室温),而在延伸温度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+。

  2.dNTP

  脱氧核糖核苷三磷酸的缩写,是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称,即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等,总浓度一般为 200pmol/ml (即饱和浓度)。dNTP 可与 Mg2+ 结合,使游离的 Mg2+ 浓度下降,影响 DNA 聚合酶的活性。

  3. 引物

  引物是一段短的单链 DNA 片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18~30bp 为宜,过短则降低特异性,过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增,同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。

  4. 模板

  模板是一段单链或者双链 DNA,提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低,但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。

  5.Taq DNA 聚合酶

  Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板,从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成(在具备模板、引物、dNTP 等的情况下)及其相辅的活性。必须一直保存于-20℃,内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃,即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。

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