从获批的11家新冠抗体检测试剂盒中解析对化学发光法...
从获批的11家新冠抗体检测试剂盒中解析对化学发光法的使用
核酸检测是目前新冠肺炎确诊的“金标准”，但核酸检测也有很大的局限性，例如当前普遍应用的鼻咽拭子采样有时难以采集到病毒，再加上试剂本身的敏感度问题，核酸检测可能会出现漏检。抗体检测作为新冠肺炎确诊的重要辅助方式，可与核酸检测互相补充验证以提高诊断的准确率，也可用于筛查无症状或轻状感染者，有助于国家对疫情整体形势进行判断和追踪。美国正准备推动全民新冠病毒抗体检测行动，筛选产生新冠病毒抗体的人，以便评估现有防疫措施的效果，并为精细化隔离及复工等决策提供参考。
目前国内新冠疫情防控形势逐渐好转，但海外疫情仍在持续恶化，短期内海外市场对抗体检测试剂盒的需求激增，海外不断抛来的订单让国内具有出口资质的试剂盒公司忙于扩大产能，加班加点地赶工生产。近日，又有2家公司的新冠病毒抗体检测试剂盒获得国家药监局的批准，抢到了进军海外市场的入场券。截止目前，国家药监局已应急批准9家企业共11个新冠抗体检测试剂盒产品（表1）。
表1 国家药监局批准新冠病毒抗体检测试剂盒清单
在国家药监局批准的抗体检测试剂盒中，有6种产品利用胶体金法，5种产品使用化学发光法。胶体金的优势是使用方便快速，成本低，应用范围广，技术难度系数相对较低，但存在灵敏度低、无法定量等局限。化学发光检测的灵敏度高，不仅可显著提高临床检测的准确性，还具备高通量、简便安全、速度快等特点。小编之前已介绍过胶体金法（文尾可查看前文），今天小编就带大家了解下化学发光法是怎么一回事。
目前药监局批准的化学发光试剂盒的检测原理是将新冠病毒抗原蛋白包被在微粒上，抗原蛋白将结合新冠肺炎患者血清中的IgG/IgM，随后加入化学标记的人IgG/IgM二抗，经过清洗去除游离态的化学标记物后再加入发光底物产生化学发光，通过测量光信号完成对血清中IgG/IgM的定性或定量检测（图1）。
那么目前用化学发光法检测新冠病毒抗体的效果到底怎么样呢？小编通过介绍一篇研究论文来带领各位看官一探究竟。
2020年3月27日，广东省组织器官区域免疫与疾病重点实验室的研究人员在预印本平台bioRxiv上发表论文"Evaluations
of serological test in the diagnosis of 2019 novel coronavirus
(SARS-CoV-2) infections during the COVID-19
outbreak"，对应用化学发光法进行新冠病毒抗体检测的灵敏度和特异性进行了研究，文章内容如下：
研究人员首先对化学发光试剂盒进行组装。他们利用原核表达系统重组表达出新冠病毒的全长核衣壳蛋白（Nucleocapsid
Protein,
以下简称N蛋白），将N蛋白与磁微粒进行偶联，用于捕获血清中的特异性抗体。同时他们对抗人IgG、IgM的抗体进行化学标记，用于检测血清中的IgG和IgM。
研究人员收集到79位新冠确诊患者的血清作为实验组，同时收集29位健康人员和51位结核病患者的血清作为对照组。利用化学发光试剂盒检测实验组和对照组的血清，研究人员发现实验组血清IgM检测信号的平均强度为对照组的6-8倍，而IgG的平均信号强度则为对照组的60-70倍，说明IgG的检测信号更强（图2）。
图2 对照组及实验组血清的IgM和IgG检测信号强度
研究人员以IgG和IgM的平均信号强度为基准线，发现在检测血清中IgG时，实验组中有65例的检测信号为阳性，对照组中有2例信号为阳性，说明IgG的检测灵敏度和特异性分别为82.28% （65/79）和97.5%（2/80）；IgM的检测灵敏度同样为82.28%（65/79），但特异性仅为81.25%（15/80），明显低于检测IgG的97.5%（表2）。
因为IgG和IgM的检测特异性差别较大，研究人员对两种检测方案与新冠确诊患者的性别、年龄和发病天数的关系进行了研究，他们发现确诊患者的性别和发病天数对IgG和IgM的检测结果无明显影响，但发现18岁以下的确诊患者其IgG和IgM的阳性检出率明显低于18岁以上的确诊患者（表3、4）。
研究人员从上述血清样本中取出65例实验组样本和64例对照组样本，对化学发光法和国产商业化ELISA试剂盒的检测效果进行了比较。两种方法的IgM检测假阳性率都为21%，而IgG检测假阳性率则较低；化学发光法的IgM和IgG检测的灵敏度都明显高于ELISA试剂盒，说明化学发光法的实际检测效果更好（表 5）。
表5 化学发光法与ELISA试剂盒用于检测新冠病毒抗体的效果比较
文章结论：在新冠病毒抗体检测中，化学发光法的实际检测效果好于ELISA试剂盒，并且使用化学发光法检测IgG的灵敏度和特异性都较高，可用于临床辅助诊断新冠肺炎。
由于这篇论文的临床样本数量较小，论文的实验结果和结论还有待于更大规模样本研究的确认。此外因为新冠疫情万分紧急，很多商业化的新冠抗体检测试剂盒还未进行严格的临床实验来验证检测效果，且试剂盒生产厂商为了赶进度，产品的质量和批间差也难以保障，因此这篇论文中化学发光法和ELISA试剂盒的检测效果差异也需要更全面的实验设计来验证。
N蛋白是新冠病毒中重要的结构蛋白，常作为新型冠状病毒抗体检测的抗原工具。这篇论文中的化学发光检测试剂盒使用的抗原蛋白即为N蛋白，保证了此试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。据小编所知，目前市场上的商业化新冠抗体检测试剂盒（胶体金法和化学发光法）中，大多数使用的抗原蛋白也都是N蛋白。由此可见，N蛋白是新冠抗体检测试剂的核心原料，其重组表达的纯度和活性对检测试剂的实际使用效果具有重要影响。
ACROBiosystems开发了His标签以及生物素标记的新冠病毒N蛋白，并验证了N蛋白与Anti-N蛋白抗体的结合活性，灵敏度能达到0.02 ng/mL，可用于不同类型试剂盒的开发中。
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不同类型N蛋白的活性验证
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SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag (C-terminus）
货号：NUN-C5227
N蛋白与Anti-N蛋白抗体的结合灵敏度为活性验证0.02 ng/mL
Immobilized
SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His Tag (Cat. No. NUN-C5227) at 2
μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27)
with a linear range of 0.02-0.6 ng/mL.
SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag (N-terminus）
货号：NUN-C51H9
N蛋白与Anti-N蛋白抗体的结合灵敏度为活性验证0.02 ng/mL
Immobilized
SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His Tag (Cat. No. NUN-C51H9) at 2
μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27)
with a linear range of 0.02-0.3 ng/mL.
Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His,Avitag?
货号：NUN-C81Q6
生物素标记N蛋白与Anti-N蛋白抗体的结合灵敏度为活性验证0.4 ng/mL
Immobilized
SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27) at 2 μg/mL (100 μL/well) can
bind Biotinylated SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His,Avitag (Cat.
No. NUN-C81Q6) with a linear range of 0.4-3 ng/mL.
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N蛋白产品列表
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货号 种属 产品名称
NUN-C51H9 SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag
NUN-C5227 SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag
NUN-C81Q6 SARS-CoV-2 Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His,Avitag?
NUN-M51H5 MERS MERS Nucleocapsid protein, His Tag
NUN-S5148 SARS SARS Nucleocapsid protein, His Tag
