功能化离子液体的合成及其在蛋白质萃取分离中的应用
蛋白质组是指一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学是在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体。蛋白质作为生物体的组成部分，在生命活动中发挥着重要的角色，如新陈代谢，基因表达，信号转换等生命现象。许多蛋白质可用于治疗或诊断应用，在治疗领域，很有必要制备纯净的不含任何对人体有危害的污染物的蛋白质样品。因此，蛋白质的分离和纯化，是现代化过程中生物技术的主要领域之一。 作为一种绿色溶剂，室温离子液体具有许多独特的物理化学性质，已获得广泛关注。功能化离子液体作为室温离子液体的延续，利用离子液体的“可设计性”，通过改变其化学结构，使其具有特定的物化属性，是能满足某些特定的应用需要的“新型绿色溶剂”。功能化离子液体已经用于有机合成、电化学及分析化学领域。在分析化学方面，主要用于CO2的吸附和金属离子的萃取，而在生物大分子的萃取分离的报道相对较少。 本文以蛋白质组为研究对象，设计合成功能性离子液体，结合现代新兴的样品前处理技术——双水相萃取技术，从样品中萃取分离蛋白质成份，系统研究了各因素对蛋白质萃取量的影响，确定了蛋白质成分最优萃取方法及萃取条件。本研究主要从以下三个方面开展： 1.氨基功能化离子液体-双水相萃取法分离卵清蛋白 以卵清蛋白为萃取目标物，将设计合成的氨基化功能离子液体结合双水相萃取法（[NH_2-pmim]Cl/K2HPO4），用于快速高效分离纯化卵清蛋白。比较了氨基功能化离子液体和常规离子液体对卵清蛋白萃取效率的影响。通过单因素实验（[NH_2-pmim]Cl水溶液的浓度、成相盐浓度、萃取温度和萃取时间）优化了[NH_2-pmim]Cl/K2HPO4双水相萃取法的萃取条件。其最佳萃取条件如下：[NH_2-pmim]Cl水溶液的浓度为0.6g/ml，成相盐浓度为0.8g/ml，萃取时间为20min，萃取温度为30℃。在最佳萃取条件下，卵清蛋白的萃取率达到94.12%。采用紫外光谱进行卵清蛋白的定性及定量分析，卵清蛋白浓度在0.1-1.0mg/ml范围内线性关系良好，线性回归方程为：Y=0.6502X+0.00589（R2=0.999）。方法学考察表明：所拟方法具有良好的精密度和重现性。采用紫外光谱、红外光谱、动态激光散射及透射电镜技术对蛋白质萃取前后的化学结构和微观结构进行考察，初步探讨了[NH_2-pmim]Cl/K2HPO4双水相体系的萃取机理。 2.胆碱类离子液体-双水相萃取法萃取分离萃取蛋白质 从生物小分子出发，合成具有两个羟基官能团的胆碱类离子液体（[OH-choline]Cl）。利用该离子液体结合双水相萃取法分离富集蛋白质。通过优化萃取条件（盐浓度，[OH-choline]Cl浓度，萃取时间和萃取温度），获得了[OH-choline]Cl结合双水相萃取蛋白质的最优条件。采用紫外可见光谱法对萃取目标-牛血清蛋白进行定性及定量分析。牛血清蛋白浓度在0.2-2.5mg/ml范围内线性关系良好，线性回归方程分别为：Y=0.61093X+0.0113(R2=0.9992)。最优萃取条件如下：盐浓度为0.7g/ml，离子液体浓度为0.6g/ml，萃取时间为25min，萃取温度为25℃。在最优萃取条件下，牛血清白蛋白的萃取率可达到100.03%。应用紫外光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、动态激光散射仪（DLS）及透射电子显微镜（TEM）表征了优化的条件下胆碱类离子液体结合双水相萃取蛋白质的机理。在最佳萃取条件下，应用该方法萃取卵清蛋白和溶菌酶，萃取率分别为96.85%和103.6%(n=3)。研究结果表明所拟方法具有良好的精密度和重现性，将所拟方法应用于蛋白质样品分析，结果满意。 3.季铵盐类离子液体-双水相萃取法萃取分离胰蛋白酶 设计合成了价格低廉的具有环氧官能团的季铵盐类离子液体[(Bu3N)-PO]Cl，结合双水相萃取法，萃取分离胰蛋白酶。通过优化萃取条件（盐浓度，[(Bu3N)-PO]Cl浓度，萃取时间和萃取温度），获得了[(Bu3N)-PO]Cl/K2HPO4双水相体系萃取胰蛋白酶的最优条件。采用紫外可见光谱法对胰蛋白酶进行定性及定量分析。胰蛋白酶浓度在0.3-1.5mg/ml范围内线性关系良好，线性回归方程分别为：Y=0.12409X+0.00353（R2=0.9996）。最优萃取条件如下：盐浓度为0.5g/ml，离子液体浓度为0.6g/ml，萃取时间为15min，萃取温度为30℃。应用紫外光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对其萃取机理进行考察。
