小麦黄化苗总mRNA的提取
[实验原理]
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。本实验以小麦为材料，采用异硫氰酸胍—苯酚—氯仿抽提法或CTAB法提取总RNA。异硫氰酸胍是高浓度变性剂，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使蛋白质与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。mRNA仅占总RNA的1%-5%，由于大多数真核mRNA
3’端具有多聚腺苷酸结构（polyA），因此可采用寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA。
[仪器、材料与试剂]
(一) 仪器和材料
紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统、小麦黄化苗
(二) 试剂
4M异硫氰酸胍、2M NaAc（pH 4.8）、4M LiCl、3M NaAc（pH5.0），以上均用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）配制，然后高压灭菌
5X甲醛凝胶电泳缓冲液：吗啉代丙烷磺酸（MOPS）0.1M、NaAc40 mM、EDTA 5 mM
高盐缓冲液：Tris-Cl 10mM；EDTA l mM；NaCI 0.5M ；pH7.4。
低盐缓冲液：Tris-Cl 10mM；EDTA l mM；NaCI 0.1M ；pH7.4。
洗脱缓冲液：Tris-Cl 10mM；EDTA l mM；pH7.4。
CTAB抽提缓冲液配制：用0.1%DEPC溶液配制2%（W/V）CTAB、2%PVP，25mM EDTA、2M
NaCl（只配至60%的终体积），于37℃过滤后灭菌，再将DEPC水配制的1M Tris-Cl（pH8.0）稀释至终浓度为100
mM，然后溶入亚精胺至终浓度为0.5g/L，4℃短期保存，-20℃长期保存。
[实验步骤]
(一)提取小麦总RNA
1、实验前10天左右播种小麦种子，生长约10cm黄化苗（避光）。
2、称取1.2g小麦叶片，剪碎（冰浴），移入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入50ml离心管。
3、加入4M异硫氰酸胍4ml，苯酚3ml，2M NaAc（pH 4.8）0.3ml，氯仿0.6ml，混匀，冰浴放置30min（破坏细胞结构，失活RNA酶）。
4、4℃，8000r/min，离心13min。弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃，1h。
5、4℃，8000r/min，离心13min。弃上清，在沉淀中加入1ml 4MLiCl，使溶解。移入1.5ml Eppendof管中，冰浴2h。
6、13000r/min，离心15min。弃上清，在沉淀中加入400uL水（经DEPC处理），再加入400uL氯仿混匀（去蛋白）。
7、13000r/min，离心6min。取上清，并加入1/10体积3MNaAc（pH5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min。
8、13000r/min，离心13min。将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次（70%乙醇用DEPC配制），室温下干燥。
9、加入100uL DEPC水溶解，-20℃保存。
注意：提取总RNA时，对所用与RNA有关的仪器进行DEPC处理．操作时应使用一次性手套，所用的溶液都需是RNA专用，以防RNA酶污染．
植物总RNA的提取也可采用CTAB法进行，方法如下：
1、在一50ml DEPC处理过的离心管中加入15ml CTAB植物RNA抽提缓冲液，并加入300ul β-巯基乙醇，混匀并预热至65℃。
1、称取2g小麦叶片，剪碎（冰浴），移入研钵，在液氮中研磨成粉末状，迅速移入加有缓冲液50ml离心管。
2、65℃水浴15min，每隔1-2min混匀一次。
3、加入等体积氯仿，振荡10min，18℃ 1000xg离心10min。
4、取上清液于一50ml DEPC处理过的离心管中，重复步骤4。
5、取上清液于一50ml DEPC处理过的离心管中，加入1/4体积的LiCl（10M），4℃过夜。
6、4℃ 10000xg离心15min。弃上清，500ul DEPC水溶解沉淀，并转入1.5ml RNase-Free的离心管中。
7、加入等体积氯仿，同步骤5，抽提2次。
8、加入2倍体积无水乙醇，-20℃ 2h。
10、4℃ 10000xg离心15min，吸干沉淀。视需要用100-500ul DEPC水溶解沉淀，-70℃保存。
(二) 在甲醛变性凝胶电泳分析总RNA、检查其完整性
1、制备1%变性琼脂糖凝胶：将0.2g琼脂糖溶于水，加入5X甲醛凝胶电泳缓冲液4mL，稍冷却加入37%甲醛3.4mL，混匀，使胶总体积为20mL。倒胶并放在空气中冷却30min．
2、50V电压电泳，至溴酚蓝移至前沿1cm处停止电泳。
3、在EB中染色15-20min，紫外灯下观察结果。
(三)mRNA的分离与纯化
1、将Oligo(dT)-cellulose装入经DEPC处理的柱中，0.1M NaOH浸泡10min，离心除去胶中溶液(350gX2min)。
2、再用DEPC处理过的水洗2遍，每次2.0mL，然后用高盐溶液洗至洗脱液pH<8.0。
3、总RNA在65℃加热5min，冰上冷却，加2倍体积的高盐溶液于总RNA中，混匀，上柱，将溶液与胶混匀，放置10min。
4、收集流出液，重复第3步操作。
5、待溶液从柱上流出后，用高盐溶液洗4次，每次2.0mL，用低盐溶液洗3次每次2.0mL，收集洗脱液。
6、离心(350g* 2min)除去胶中剩余溶液，每次用0.25m1洗脱液，离心(3500*2 min)收集洗脱液，洗3次，总共约0.75mL洗脱液。
7、将洗脱液分成两部分，分别加入0.85mL无水乙醇和0.18mL 7.5M NH4Cl，-20℃放置30min，离心(12 000gXl5rain)，用75％乙醇淋洗，抽干后置于-80℃保存。
8、50V电压电泳，EB中染色，紫外灯下观察结果
[实验结果]
从小麦中提取的总RNA以及纯化得到mRNA的甲醛变性凝胶电泳贯观察：可以看出总RNA有三条带（28S、18S、5S），而且28S条带以上还有明显条带，说明总RNA还未降解。mRNA中没有小条带，说明mRNA也未降解。
