POCT免疫诊断产品主流技术入门
一、免疫层析技术
图1 薄层色谱法
二、免疫标记技术
（1）胶体金法
胶体金是指胶体状的一种金颗粒，是氯金酸（HAuCl4)在还原剂作用下聚合成纳米尺寸的金颗粒，由于静电作用而形成稳定的胶体状态。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可以与蛋白质分子的正电荷基团形成静电结合。胶体金免疫标记技术，是利用胶体金标记单克隆抗体，可用于快速检测蛋白质类和多肽类抗原，如激素（早孕试纸）、HCV、HIV抗原和抗体测定。因为胶体金本身为红色，抗原抗体在检测区的特异性反应会导至胶体金积聚，使得该区域显示一定深度的颜色，通过眼睛观察就可以获得定性的结果。使用CCD相机对显色图片进行灰度量化分析，可以得到半定量结果。
胶体金免疫标记的优点是：几乎可以标记所有的蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，基本不改变被标记蛋白活性；检测结果直接用颜色显示，肉眼就可以判断，操作简单。缺点是：采用物理吸附的方法结合，抗原/抗体容易从金颗粒表面脱离，标记物不稳定；只能给出定性或者半定量结果。
图2 胶体金
（2）荧光法
荧光法是用荧光染料与抗体结合形成荧光标记抗体，通过抗原抗体反应对待测物进行检测。荧光染料是一种吸收某一波长的光后能发射出另一波长大于吸收光的有机化合物。常用的荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC)或罗丹明B等。
荧光免疫标记可以用荧光素直接标记，也可以用荧光微球标记。荧光微球是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键法、共聚法、包埋法等方法吸附或者包埋到粒子里形成直径纳米至微米（0.01-10 μm）范围内的微球。荧光微球粒度均一，单分散性好，有较高的生物相容性，形成微球后染料淬灭大大减少，发光强且稳定。荧光微球免疫标记比胶体金法灵敏10-100倍，可以对待测物进行定量测定；荧光微球免疫标记的缺点是荧光染料系物理掺杂，容易发生泄漏，同时高分子微球表面修饰不够灵活，且由于多数具有疏水性质，而易发生非特异性吸附。
图3 荧光免疫检测原理图
以上两种标记方法技术比较成熟，所以应用最为广泛。目前大部分免疫诊断POCT产品都是基于这两种方法。但是传统的荧光标记的缺点是无法消除激发光以及自发荧光干扰，因此会影响检测的灵敏度。下面介绍几种特殊的，但已经应用到POCT产品中的标记技术。
（3）上转发光技术
上转发光是一种反斯托克斯效应。传统的荧光发射是通过短波长的高能量光激发出长波长的低能量光，称为斯托克斯（Stokes）效应或能量的下转换发光。而上转换发光则相反，是低能量的红外光激发，发射高能量的可见光。并且此上转发光与传统的反Stokes过程（例如双光子激发和多光子激发）不同，不需要昂贵的脉冲激光器来激发，可以由低功率的连续波激光激发。
上转换发光需要一种特殊的发光材料，即掺杂稀土离子的化合物。由于天然的生物材料不具备上转发光特性，所以可以实现较高的信噪比和灵敏度，适合定量检测。但目前稀土离子发光颗粒和上转发光技术拥有独特技术和ZL保护，目前所知国内只有北京热景生物的POCT产品采用的是此种技术，其本质上依然属于荧光范畴。
图4 两个光子激发产生上转发光的过程示意图
（4）量子点技术
图5 量子点
（5）时间分辨荧光技术
图6 时间分辨检测原理
三、试纸条
目前免疫诊断POCT产品大多都是以试纸条为反应载体的固相层析平台。试纸条以材料膜为载体，通过微孔膜的毛细作用，待测液体由试纸一端渗透到另一端，使抗原抗体反应，通过检测反应区的特异性抗原抗体复合物的颜色或者发光信号来反应待测物含量。一张试纸条主要包括样品垫、结合垫（即标记垫）、硝酸纤维素膜（简称NC膜，即反应膜）、吸收垫和背衬垫等部分，不同部分需选择不同的膜材料。涉及到的膜材料包括玻璃纤维素膜、聚酯纤维膜、NC膜、滤纸等。其中NC膜是C/T线的载体，也是免疫反应发生处，是最重要的膜材料，需要根据灵敏度要求选择不同的膜孔大小，从而决定不同的层析速度。NC膜上固定有待测样本的捕获试剂，捕获试剂在膜上的吸附效果对检测结果非常重要。另外，结合垫上预先喷涂有标记结合物，结合垫材料需要有较好的亲水性以及结合物释放能力。
以试纸条为载体的免疫层析平台，易受膜材料的孔径、材质、环境温度及湿度影响，液体流速、反应时间及抗原抗体结合概率不均一，膜材料的批间差异导至灵敏度和精密度等性能指标很难提升。
四、微流控芯片
微流控（Microfluidic），顾名思义就是微小流体控制。微流控芯片又称芯片实验室（Lab-on-a-Chip），是指将生物、化学等实验室的基本功能，诸如样品制备、反应、分离和检测等集中到一个在具有微纳米尺度流道的几平方厘米的芯片上。微流控芯片具有多种单元技术在微小可控平台上灵活组合和规模集成的特点。通过芯片材料的选取、流道表面处理技术以及流道结构的特殊设计，可以实现对液体运动及反应的控制，获得比试纸条更高的检测灵敏度和精密度。微流控芯片技术必将成为新一代POCT的主流技术。目前市场上几个代表性的使用微流控芯片产品有美国Alere公司的Triage免疫诊断平台、微点生物的mLabs免疫诊断平台和韩国NanoEnTek公司的FREND system。
五、免疫比浊分析技术
免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，是一种液相分析方法。其基本原理是当抗原抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适时（一般规定抗体过量），形成的可溶性免疫复合物在促聚剂的作用下，自液相析出形成微粒，使反应液出现浊度。当光线通过含有免疫复合物颗粒的反应液时，光的传播方向会因为免疫复合物颗粒的作用发生改变，使用一定的探测器装置，可以获得相应的散射光和透射光，用于检测的浊度变化。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。免疫比浊法在临床试验中需要注意抗原和抗体的比例要适合，否则会出现可溶性复合物，从而造成误差；而且此种检测方法容易受血脂的影响，而导至结果有偏差。
乳胶增强免疫比浊法，是在上述原理基础上，将抗原、抗体连接到特定大小的乳胶微球上，在抗原抗体特异集合后，产生较大的复合物，从而提高浊度变化的本底和幅度，大幅提高检测的灵敏度。乳胶增强免疫浊度法主要用于常规蛋白质的检测（感染标志物、免疫球蛋白，补体系统、风湿标志物，肾脏标志物等），当测定激素、药物，或血清中低浓度、低分子量蛋白质或脂质形成的中低浓度复合物时，由于其不能显著改变平均分子量，因此，乳胶增强免疫浊度法的局限性体现在临床测定项目以中等灵敏度要求的项目为主。
六、化学发光免疫分析
化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定和高特异性的免疫反应结合起来的一种技术，是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，因为其灵敏度高、特异性强、线性范围宽、试剂稳定和无放射性污染等优点，已被广泛用于机体免疫功能、传染性疾病、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功能等的检测。
化学发光是指伴随化学反应过程产生的光发射现象。通过化学发光相关物质标记的抗原或抗体，与待测物进行免疫反应后，分离游离态的化学发光标记物后，加入发光试剂产生发光信号，通过测定发光强度得出待测物含量。
化学发光免疫分析系统包括固相载体和发光体系两大核心技术：（1）采用的固相载体有塑胶微粒、超顺磁微粒、弹性塑料管、塑料珠等，其中磁微粒具有包被量大，易于实现自动化的优势；（2）采用的化学发光体系有酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光三种。其中酶促化学发光分为辣根过氧化物酶体系和碱性磷酸酶体系，直接发光法主要有吖啶酯和异鲁米诺发光体系。目前化学发光免疫分析主要用于微孔板式和大型全自动发光分析仪上。
